4蔗糖酶理论讲授.ppt

啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验 一、目的要求 1、熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2、掌握 3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法。 凝胶过滤层析的原理.MPG 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。 如何选择离子交换介质 装柱：本实验使用DEAE-52离子交换树脂，先把柱内装1/3的5mmol/L pH6.0磷酸起始缓冲液，把柱子垂直固定；将DEAE-52离子交换树脂用起始缓冲液调稀、搅匀后加入，柱内的DEAE-52离子交换树脂应非常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要平整，床高约1.5cm为宜。用起始缓冲液洗柱，控制好流速（防止流干）； 平衡：用5mmol/L pH6.0 的磷酸起始缓冲液平衡过夜。 上样：将储液瓶中的缓冲液放尽，封闭出口，将E2 加入到储液瓶中，连接出口与离子交换柱的进液管道，打开截