第三章 蛋白质研究技术(2).pptVIP

第三章 蛋白质研究技术 第一节 蛋白质的分离纯化 第二节 蛋白质的鉴定 第三节 蛋白质的检测 第四节 蛋白质的结构分析 第一节 蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质分离纯化的基本原则 二、蛋白质分离纯化的方法 一、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择丰度高、便于提取的材料 （磷酸单脂酶,肝、胰、脾丰富，但选几乎不含磷酸二脂酶的前列腺） 2、了解目的蛋白质的稳定性 （肝素材料的冷冻和干燥） 3、探索有效的抽提和浓缩方法 (包括细胞破碎：机械、细胞溶解与自溶；抽提：稀酸减、有机溶剂、缓冲系统；浓缩：沉淀、吸附、超滤、透析、冻干等) 4、建立一套层析组合方法和检测方法 　　（如吸附、离子交换、亲和层析、凝胶过滤；纯化评价） 5、包装、贮存方法（生产日期、批次、含量、活性或效价） 二、蛋白质分离纯化的方法 粗提： 1.盐析: 固体加入法： 饱和溶液加入法: 2.有机溶剂沉淀: 3.结晶（10-50mg/ml） 4.等电点沉淀 精提 ：1.离心（centrifugation） 　 2.电泳（electrophoresis） 　 3.层析（chromatography） 1.离心（centrifugation） 原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及大分子）有不同质量（mass）或密度（density），故在离心场中有不同沉降速率。 ? 蛋白质分子量差别很大，密度差别很小（不超过15% ）。蛋白质的平均密度是 1.37 g/cm3。结合蛋白密度差异较大。 ?沉降系数（sedimentation constant）：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度（S）。 离心（centrifugation） ①.差速离心（differential centrifugation） ②.速率区带离心（rate-zonal centrifugation） ①.差速离心（differential centrifugation）　　利用不同物质沉降速率的差异，通过离心速度差异分离不同质量颗粒的离心技术。 ?从组织匀浆中将可溶性的蛋白质与不溶性成分分开。 ?离心后，蛋白质留在上清液（Supernatant）中，其他成分形成沉淀（Pellet） 细胞成份的差速离心分离 ②.速率区带离心（rate-zonal　centrifugation）　　也称平衡密度梯度离心，根据颗粒在介质中的沉降速度差异分离目标颗粒的方法。 ?蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度； ?超速离心机（≈40,000 r/min） ?离心后，分离物分布在相应的密度区带内； 注意： ?控制时间：太短，不能充分分离；太长，分离物沉淀到离心管底部。 ?不能精确测定分子量，因为蛋白质的 形状差异影响沉降率； ?一次分离多种不同类型聚合物或颗粒 的最有效方法 　多用于分离细胞器，ＤＮＡ 2. 电泳（electrophoresis）  带电颗粒在电场中的移动速度的差异,从而将其分离。由电荷 –质量比决定。电泳分类： 按支持物:移动界面电泳,聚焦电泳,区带电泳（凝胶、线丝）等 按电泳装置:水平平板,垂直平板,圆盘,双向电泳,毛细管电泳， 脉冲电泳。 按电电流（压）：常压电泳，高压电源。 常用的电泳方法 ①SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） ②等电聚焦（isoelectric focusing ，IEF ） ③双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） ④脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis） ①.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 凝胶 ?丙烯酰胺（acrylamide），甲叉双丙烯酰胺（methylene　bisacrylamide）聚合而成；T%= (a:单体g;b:双体g; m:溶液体积) ?凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度；C%= (a:b=19:1) ?凝胶有分子筛效应。 SDS SDS（sodium dodecyl sulfate） ?阴离子洗涤剂，几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，使亚基解聚(巯基乙醇)，使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质构形对迁移率（migration rate）的影响； ? SDS以1:2 的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与