五目的基因的获取.pptVIP

例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104 bp N= ln (1-p) ln (1-f) = ln (1-99%) ln (1-f) = 4.61× G f N= 4.61× G f G：Genome大小；f：fragment大小 N= 4.61× G f = 4.61× 3×109 1.7×104 = 8.1×105 1. cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。 2. cDNA library 二、 cDNA文库的构建 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。 （5）以mRNA为材料，适用于某些RNA病毒基因组结构研究。 3. cDNA文库的特点 注：cDNA文库包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因。 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-5%。 （2）mRNA的分离纯化 ① 原理 ② mRNA的分离纯化 Column（柱） （1）总RNA（total RNA）提取 4. 构建cDNA文库的一般步骤 反转录酶 （3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 引物 ② 降解mRNA模板 或RNaseH 碱 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。 cDNA第一链 5’ cDNA第二链合成 DNA聚合酶 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ ③ cDNA第二链合成 ④去掉发卡结构 核酸酶S1 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 5’ 3’ 自我引导合成法 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 妙用RNaseH 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 大肠杆菌RNaseH酶降解取代法 dCTP TdT Oligo(dG)寡聚引物引导合成法： 获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 5‘ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ppp’5 G G AAAAACCCCOH3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 蔗糖梯度离心 退火 oligo(dG) Klenow dNTPs 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 ﹙4﹚cDNA与载体连接： 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 5. cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目: N= ln (1-p) ln (1-f ) p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） f: 某一mRNA丰度与细胞整个mRNA数的比值 N：所需的重组载体数（克隆数） 理论公式：细胞m