线粒体荧光标记的单颗粒水平高通量评价方法.pdf

第44卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究报告 第8期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2016年8月 ChineseJournal of Analytical Chemistry 1171~1177 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.160102 线粒体荧光标记的单颗粒水平高通量评估方法 韩锦艳摇 许静怡摇 张 翔摇 周颖星摇 陈超翔摇 颜晓梅* (厦门大学化学化工学院化学生物学系,谱学分析与仪器教育部重点实验室, 化学生物学福建省重点实验室,福建 厦门361005) 摘摇 要摇 线粒体是真核细胞能量代谢和信号转导的调控中枢,虽然各种灵敏、特异的线粒体荧光标记技术已 经被广泛应用于线粒体研究,但仍缺乏单线粒体水平的荧光染色性能评估方法。 基于超高灵敏流式检测技术 (High sensitivity flow cytometry,HSFCM)能对单个线粒体进行高灵敏、高通量、多参数定量分析的独特优势, 本研究发展了一种单线粒体水平的荧光标记高通量评估方法。 将携带靶向线粒体绿色荧光蛋白基因的 pAcGFP1鄄Mito质粒转染至人宫颈癌HeLa细胞中,用G418筛选出稳定转染细胞,分别从瞬时转染和稳定转染 的细胞中提取线粒体。 此外,从未转染质粒的正常HeLa细胞中提取线粒体,分别进行MitoTracker Green标记 以及SYTO62线粒体DNA染色,应用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置在单线粒体水平对这4 种线 粒体标记方法的荧光亮度、标记效率和稳定性进行评估。 实验结果表明,稳定转染细胞中单个线粒体的绿色 荧光蛋白(GFP)荧光亮度为瞬时转染的17.7倍,比MitoTracker Green标记的线粒体亮度高约两个数量级,且 标记稳定性好。 本研究为线粒体标记方法的选择提供了一种先进的分析方法。 关键词摇 线粒体;超高灵敏流式检测技术;瞬时转染;稳定转染;染料标记 1摇 引摇 言 [1] [2] 线粒体不仅是细胞的能量工厂 ,而且还是细胞内多种信号转导的调控中枢 ,如自噬、细胞凋亡、 [3] 固有免疫等。 许多人类疾病均与线粒体功能异常密切相关,包括神经退行性疾病、心肌病、癌症等 。 因 [4] 此,线粒体的结构与功能研究对于疾病诊治以及基础科学研究具有重要意义 ,而荧光标记为线粒体的结 [5,6] 构与功能研究提供了高灵敏、高特异性的实验方法 。 目前,线粒体的荧光标记方法主要有特异性染料 标记和蛋白标记。 染料标记操作简单,而蛋白标记则需要借助转染技术。 转染是指真核细胞由于外源 DNA掺入而获得新的遗传标志的过程,包括瞬时转染和稳定转染,两者的区别在于外源DNA 是否整合到 宿主细胞的染色体中。 瞬时转染操作相对简单,实验周期短,但是蛋白表达不稳定,需要现转现用;稳定 转染蛋白表达稳定,实验重现性好,但是外源基因整合几率小,筛选所需时间长。 在线粒体的结构与功 能研究中,线粒体荧光标记的荧光亮度、标记效率和标记稳定性等是评价标记方法的重要指标。 根据细胞的功能和能量状态的不同,一个细胞内含有的线粒体的数目从几十个到数千个不等,能量 [7] 需求越高的细胞含有的线粒体数目越多 ,且同一细胞