重组dna导入宿主细胞与转化子的筛选.ppt

第一节??????? 重组DNA向宿主细胞的导入 第二节??????? 转化子的筛选与鉴定 第三节??????? 目的基因序列测定 第一节??????? 重组DNA向宿主细胞的导入 一、转化 二、通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染/转导作用传递遗传物质 一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞 1928年, 美国的Oswald, Avery 首次开展了肺炎球菌的转化试验 感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电穿孔法。 ㈠ 原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 ㈡ 化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。 1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下, 用预冷的CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内 。 用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物而被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-). 2.方法 : （1）感受态细菌的制备 （2）转化 （1）感受态细菌的制备 接种一环DH5?于2ml LB中 37℃，振荡过夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 离心（5K，5’） 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20’ 离心 收集菌体 加入100ul100mM预冷CaCl2 混匀 ㈢电穿孔法 原理：利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表面形成暂时性的微孔, 质粒DNA可乘隙而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。 它比CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达109～1010个转化子／μg DNA）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且适用于任何菌株。 二、通过接合作用传递质粒DNA F质粒（F因子）又称性质粒, 除了含有自我复制基因外, 还带有一套接合转移的基因, 凡携有F质粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。F+菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌）发生接触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F－-菌株转变成 F+菌株。质粒由F+向F－菌的转移过程叫接合作用传递质粒, 又称质粒的接合传递。凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系（Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传递质粒DNA, F+菌株可失去F质粒, F－菌也可获得F质粒, 其转移难以人为控制,又不稳定， 通常不用作克隆载体。 接合---- F+×F－ 三、通过转染/转导作用传递遗传物质 ㈠ 转染 病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。 ㈡ 转导 以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。 原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA, 体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。 2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA导入宿主菌体内 第二节??????? 转化子的筛选与鉴定 一、利用遗传标志的表型特征筛选 二、根据重组子的结构特征筛选 一、利用遗传标志的表型特征筛选 ㈠ 由载体提供的性状进行筛选 1. 抗菌素抗性标记筛选 2. 抗性基因的插入失活筛选 3. β-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选 法及其α-互补的原理 ㈡ 根据插入基因的遗传性状进行筛选 亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长， 当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。 α-互补的原理 所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1只含LacI和LacZ的N端145个氨基酸的α肽；突变体2缺乏LacZ的N端α肽），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X-gal（5-溴-4-