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溶菌酶的紫外分光光度法检测 《仪器仪表与分析监测92006年第2期 溶菌酶的紫外分光光度法检测 DetectioninLysozymebyUV--spectrophotometry 祁静 (渤海大学化学化工学院辽宁锦州121003) [摘要]文章采用紫外分光光度法对蛋清中溶菌酶的含量进行了分析检测,并进行了方法的稳 定性,准确度,精密度,检出限,回收率的实验.结果表明,与传统测定溶菌酶的方法比较,紫外分光光度 法具有简便,快速,经济,准确等优点. [关键词]溶菌酶紫外分光光度法蛋清分析检测 [中图分类号]0657.32[文献标识码]A 溶菌酶又称胞壁质酶(Muramidase),是一种碱 性蛋白质,它在自然界中广泛存在于哺乳动物乳汁, 体液,禽类的蛋白,微生物体内及木瓜,卷心菜,大麦 等植物中.其中以蛋清中的溶菌酶的含量最为丰富, 可达0.3.溶菌酶具有溶菌,杀菌,抗病毒,抗肿瘤 细胞的作用,而且对人体无任何毒副作用.因此它在 食品工业,医疗,生物学等领域有着广泛的应用,溶 菌酶含量的检测就具有了现实意义. 传统的对溶菌酶的定量分析方法是显色法.即 根据溶菌酶通过水解细菌细胞壁中的粘多糖而使之 裂解这一特性,将待测样品和一定量的染色小球菌 在适宜的条件下反应,染色小球菌被样品中的溶菌 酶溶解,而释放出颜色,其颜色的深浅与溶菌酶的含 量呈正比,再利用可见分光光度计绘制标准曲线来 确定溶菌酶的含量.传统方法存在一定的缺点,其一 是因为要用染色小球菌,这种小球菌造价比较昂贵; 其二此方法的操作比较麻烦,要求在无菌的条件下 进行操作,这对于工业生产来说即不经济又不方便. 本文尝试用紫外分光光度法对溶菌酶的含量进行分 析检测. l实验部分 1.1仪器和试剂 仪器:UV一1600型紫外可见分光光度计(北京 瑞利分析仪器公司),测光方式为双光束,分光器为 消象差型闪耀全息光栅,波长扫描范围为190～1100 nm;1cm石英比色皿;FA1004电子分析天平(万 分之一),量筒,移液管,容量瓶,冰箱. 试剂:溶菌酶标准品(优级纯),氯化钠(分析 一 34一 纯),鸡蛋(市售,新鲜),二次蒸馏水.氯化钠溶液:分 析纯的氯化钠溶解于二次蒸馏水中配制成0.85 (w/v)的溶液. 1.2检测方法 1.2.1溶剂的选择和溶菌酶使用液的配制 根据有关文献和国家标准的要求,进行了反复 的实验,确定以浓度为0.85的氯化钠溶液作为检 测溶剂并作为测试的参比溶液. 用分析天平准确称取溶菌酶标准品试剂 0.5000g,以0.85的氯化钠溶液为溶剂稀释10 000倍,得到50.O0t~g/mL的溶菌酶标准使用液.密 封于冰箱中冷藏保存备用. 1.2.2最大吸收波长的选择 取上述溶菌酶使用液1mL,用UV一1600型紫 外可见分光光度计在248～340nm紫外波长区域 内进行波长扫描得吸收曲线,如图1所示.此吸收曲 线在281nm处有最大吸收峰. 图1溶菌酶溶液的吸收峰 1.2.3标准曲线的绘制 分别吸取溶菌酶标准使用液1.O0,2.O0,3.O0, 4.O0,5.O0mL于10mL容量瓶中,以0.85的氯 溶菌酶的紫外分光光度法检测祁静 化钠溶液为溶剂稀释至刻度,摇匀.用1cm比色皿, 以0.85的氯化钠溶液为参比溶液,于入…-_281 nm处依次测定各标准溶液的吸光度并绘制标准曲 线.如图2所示. C(ue/m1) 图2溶菌酶溶液的标准曲线 1.2.4样品的测定 准确称取新鲜鸡蛋的蛋清样品0.5921g,溶解 于0.859/6的氯化钠溶液中并定容至1O0.0ml.按 照标准曲线的操作步骤,在入…一281nm处测量此 样品溶液的吸光度.平行测定5次取结果的平均值, 由标准曲线上确定此吸光度对应的溶菌酶的含量. 2结果与讨论 2.1检测结果 得到蛋清中溶菌酶的浓度为17.41ptg/mL.蛋清中 溶菌酶的含量一[(17.41ug/mL×100.0mI)/ (0.5921×10)]×1009/5—0.29409/5.此结果与相关 文献报道的蛋清中溶菌酶的含量达0.39/6左右相吻 合,证明实验结果正确.标准曲线的回归方程的相关 系数R一0.9998,说明标准曲线在溶菌酶的浓度为 0～25.O0~g/mL之间线性关系良好. 2.2方法的稳定性 取浓度为5.000~g/mL的溶菌酶溶液6份按 照本文前述的测定方法,分别于1,2,3,4,5,6h吸 光度值,结果如表1所示.计算结果的RSD一 0.9209/6,证明此方法的测定结果稳定. 表1稳定性实验 时间(h)123456 吸光度A0.1141O.11580.11490.1152O.11460.1155 2.3方法的检出限 在选定的入射波长入…一281nm处,平行测定 空白参比液10次,数据记录如表2所示. 计算10