实验三 双水相萃取糖化酶1.docVIP

生物工程专业实验之三 双水相萃取糖化酶 实验目的 1. 通过实验使学生了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用； 2. 加深对分配系数K、相比R、收率Y等基本概念的认识及相图的制作； 3. 掌握液液萃取中基本实验技术； 实验原理 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相。原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时，都可分成两相，构成双水相体系，几种典型的双水相系统见表一。通过溶质在相间分配系数的差异而进行萃取的方法称为双水相萃取。 表一 几种典型的双水相系统 聚丙二醇 聚乙二醇，聚乙烯醇，葡聚糖（Dex），羟丙基葡聚糖 聚乙二醇 聚乙烯醇，葡聚糖（Dex），聚乙烯吡咯烷酮 硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇 甲基纤维素 羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基纤维素钠盐 聚乙二醇 磷酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，酒石酸钾钠 双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，其中水占有较大的比例（70-95%），相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点；在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。 生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Ct/Cb）。在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，利用双水相技术，通过大量实验研究，可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。在生化分离中得到广泛应用的双水相体系有：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)体系，PEG/盐等体系。 分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的产物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，引起年度太高而限制了它们的应用。PEG和Dex因其无毒性和良好的可调性而得到广泛的应用。 糖化酶亦称淀粉α-1,4葡萄糖苷酶。这类酶作用于淀粉分子末端，从淀粉非还原性末端顺次切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖。它们也能作用于支链淀粉的α-1,6键，但速度较慢，因此分解产物全部为葡萄糖，作用结果使糖的还原能力迅速增高。糖化酶在食品、酿造工业上有着广泛用途，是酶制剂工业上一个重要品种。国内生产糖化酶的菌种主要是黑曲霉和根霉。 本实验选用PEG400-(NH4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。 表观分配系数： 相比: 收率: 式中:Cb、Ct 分别为下、上相酶浓度（活性）； Vb、Vt分别为下相、上相的体积。 分配系数K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 物料衡算：加入的原液总酶活=上相酶活×上相体积+下相酶活×下相体积 实验仪器与药品 仪器：天平、恒温水浴、离心机、液相混合器；刻度试管、吸管、酸式滴定管等； 药品：发酵液、PEG400、(NH4)2SO4、NaOH(C.P)、2%可溶淀粉、0.15 M NaOH、1 M H2SO4； 实验步骤 1. PEG400-(NH4)2SO4双水相系统相图的制作 水性两相的形成条件和定量关系常用相图表示，由上、下相中PEG和(NH4)2SO4的浓度可在PEG-(NH4)2SO4浓度图中得到点，顺次连接这些点得到一曲线，称为双节线。双节线下方为一相区，上方为两相区。 1.1 配制40％的硫酸铵溶液（已经配好）。在具塞三角瓶中准确称量约7 g左右，实验中量取7.19g的PEG400； 1.2 按实验记录部分的表依次进行，先加入5 ml水（此时体系澄清）。然后用滴定管慢慢加入40％(NH4)2SO4溶液，不断摇匀，直至试管开始出现混浊为止，记录加入的(NH4)2SO4的体积和质量； 1.3 按实验记录部分的表依次进行，加入适量水（水的加量），使体系变澄清，并继续加入40％(NH4)2SO4，使系统再次变混浊，记录加入的体积和质量； 1.4 如此反复操作，计算达到混浊时PEG和(NH4)2SO4在系统中的重量百分浓度，得出PEG和(NH4)2SO4的双节线图。 2. 双水相系统中蛋白质分配系数的测定 2.1 按实验记录部分的表中所示的顺序，干燥的50ml