生物基因工程的实际操作过程.pptVIP

生物工程专业核心课程 一、DNA的体外重组（切与接） 三、转化子的筛选和鉴定（检） 1. 蛋白质生物功能测定法 淀粉酶目的基因的鉴定： 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于 水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状； 将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组 子可将其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为 可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈； 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定。 （三）外源基因产物检测 抗菌素抗性基因的鉴定： 在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生。 抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子 抗菌素抗性基因的鉴定： 目的重组子 诱导抗性 抽取重组质粒 再次转化 DNA结合蛋白编码基因的鉴定： 用聚乙烯薄膜影印裂解平板 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 80℃烘干固定影印薄膜 与探针溶液中杂交 洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 探针选用能与目标蛋白特异性结合的DNA片段 影印 洗涤 杂交 感光 聚乙烯薄膜 转化率的影响因素 2.受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。 转化率的影响因素 3.转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106-107/mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105-106/mg DNA λ-DNA转染 107-108/mg DNA 电穿孔转化 106-109/mg DNA 扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作 （三）转化细胞的扩增 扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用 于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 转化子 重组子 目的重组子 （一）载体遗传标记检测 1.抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本原理： ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori 抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子 将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板； 再将Ap平板上的转化子影印至含 有 Ap和Tc的平板上； 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 平板上不长的转化子即为重组子。 Ap Ap + Tc 影印 挑选 2.营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子； 其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。 常见的营养缺陷型筛选标记： 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 dCDP dTDP dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 3.显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分