第3章基因工程的载体.ppt

* 西南大学生物技术专业 基因工程 * 4、游离出来的(+)链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从(+) DNA链上脱落下来，余下的M13 (+)链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 二和三：略 四、丝状噬菌体载体的用途和问题 用途：制备单链DNA，用作探针、测序等。 问题：外源DNA的部分缺失、外源DNA的单方向插入等。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 五、噬菌粒 噬菌粒实际上是带有噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状噬菌体的间隔区。 可以象质粒一样增殖，而细菌被M13（f1）感染后质粒启动滚环复制，产生质粒DNA一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中。 pUC118和pUC119，pBluescript SK(±)和pBluescript KS (±)等。 特征：双链DNA稳定、高产，有常规质粒特征；克隆操作简单；可插入的外源DNA可长达10kb。 随着PCR技术的广泛应用，许多由丝状噬菌体载体完成的工作现在已由PCR可以取代。 * * * * 西南大学生物技术专业 基因工程 西南大学生物技术专业 基因工程 第三章 基因工程的载体 前言 载体通论 第一节 质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 第三节 单链丝状噬菌体载体 本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！ 前言 载体通论 一、基本概念 利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆(gene cloning)。 克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。 基因文库(gene library)：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。 载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子。 二、分类 克隆载体 表达载体 质粒载体 噬菌体载体 人工染色体 按载体功能分 按载体性质分 表达体系 载体 宿主 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌 酵母表达体系 大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒 酵母 转基因植物体系 大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（Ti质粒）、病毒等 植株 哺乳细胞表达体系 大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（病毒）、脂质体等 培养动物细胞 基因直接导入 DNA本身（基因枪微粒轰击法等） 生殖细胞、体细胞、个体 三、基因工程载体必须具备的条件： ※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目 （5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件 第一节 质粒载体 一、质粒(plasmid)的基本特性 Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA (covalently closed circular, cccDNA)，大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。 编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。 1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。 2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。 pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。 3、质粒的不亲和性(incompatibility)：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。不相容群。 4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。 质粒载体应具备的条件： 1 有特定