考马斯亮蓝法测蛋白质含量.docVIP

标题：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的检验方法（第0次修改） 第 PAGE 1 页 共3页 PAGE 0 作业指导书 标题：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的检验方法 文件编号： 修改次数：0次 编写： 审核： 批准： 修改记录 修改页码 修改内容 修改人 批准人 生效日期 1．目的 1.学习一种蛋白质染色测定的方法 2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 2．适用范围 组织中的蛋白质测定。 3．职责 3.1 检测人员按照本作业指导书进行该项试验，作好试验记录。 3.2 审核人员负责试验的审核，保证试验的准确性和科学性。 3.3 科室负责人负责监督试验指导书的执行。 4．正文 4.1 试验原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 4.2 材料、试剂与器具 （一）试剂 1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。 3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml （二）器具 1、试管及试管架 2、移液管（1ml,5ml） 3、可见光分光光度计 4.3 试验操作步骤 标准曲线的制作 1、取7只试管，按下表加入试剂 编码 0 1 2 3 4 5 6 牛乳清蛋白 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝试剂 5 5 5 5 5 5 5 2、将试管摇匀，放置20分钟。 3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。 4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。? （二）样品测定 1、取一只试管加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ML，蒸馏水0.8ML，考马斯亮蓝5ML。 2、将试管摇匀放置20分钟。 3、比色测定吸光值A595nm，考马斯亮蓝试剂调零。 4.5 注意事项 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。