实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性.ppt

马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 Email:myc0307@ 现代微生物学实验技术 实 验 内 容 ? 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ? 转座子随机突变及目的表型的筛选 ? 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ? 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ? 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 牛伯庆 王子元 实验目的 了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白的原理； 掌握SDS的原理、实验操作过程及重要性。 基因的基本结构 ORF：Opening Reading Frame 启动子 终止子 转录区 基 因 RNA起始点 ATG TGA 核糖体结合位点 实验原理 影响基因表达的因素： 启动子： 控制基因表达的第一步，是高表达的关键； 结构基因：密码子偏好性； 表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。 实验原理 目的基因： 受噬菌体T7强转录、 翻译及终止信号控制； Lac操纵子； T7 RNA聚合酶启动； IPTG诱导； 有His-tag标签； 大肠杆菌BL21， 实验原理 操纵基因 结构基因 调节基因 启动子 阻遏物 ?-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰基转移酶 乳糖操纵子 切 接 转 增 筛 表达 实验材料 菌株 pET28a-54/BL21(DE3)，pET28a-cho/BL21(DE3)，pET28a/BL21(DE3) 2. 培养基及试剂 (1). 培养基： LB液体培养基 (2). 电泳溶液 凝胶贮存液： 丙烯酰胺 29g；甲叉丙烯酰胺 1g，加水至100ml，置于棕色瓶中，4℃存放。 B. 8×浓缩胶缓冲液： 1mol/L Tris-HCl,pH6.8, 4℃存放。 C. 4×分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tis-HCl,pH8.8, 4℃存放。 D. Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris 3.03g, 甘氨酸 14.4g，SDS 1.0g，pH 8.3，4℃存放。 E. 上样缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),100 mmol/L 巯基乙醇， 2%(m/v) SDS,0.1% 溴酚蓝，10% (v/v)甘油。 F. 10% SDS G. 10% 过硫酸铵 H. TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 3. 仪器设备 垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等 实验步骤 1. 菌种的活化及酶的诱导表达 菌种活化：分别挑 pET28a-54/BL21(DE3)、pET28a-cho/BL21(DE3)、pET28a/BL21(DE3)单菌落于5ml LB+Km液体培养基37℃培养18h。 酶的诱导表达：1%的接种量转接于20ml LB+Km液体培养基37℃培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30℃摇床振荡培养2-6h，以空载体为对照。 2. 融合蛋白的可溶性分析： (1). 12000rpm 离心收集菌体，溶于无菌水中； (2). 超声破碎菌体：功率 200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清； (3). 12000rpm离心5min收集上清； (4). 将沉淀悬于无菌水中； (5). 分别取上清、沉淀做样品处理及SDS分析。 3. 样品处理： 向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20℃保存。 4. 电泳 制胶 点样 电泳 染(脱)色 表 分离胶与浓缩胶的配制 12%分离胶 5%浓缩胶 水 40%凝胶储液(ml) 分离胶缓冲液(ml) 浓缩胶缓冲液(ml) 10% SDS (ml) 10% 过硫酸铵 (ml) TEMED (ml) 总体积 (ml) 6.394 4.5 3.8 — 0.15 0.15 0.006 15 3.64 0.625 — 0.63 0.05 0.05 0.005 5 注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED 制胶： 事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。 点样： 小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40μl。注：一定要记住点样顺序 电泳： 稳压，浓缩胶电压 60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电