第四章 电泳图谱的图像分析及细胞蛋白谱的建立.pptVIP

蛋白质组学 主讲教师：张玲 2007.10.11 回顾 PDQuest 软件简介 PDQuest软件是显示（imaging）、分析（analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个软件包 硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系统 软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA PDQuest 软件的使用 凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立： PDQuest 软件 一、 图象采集与加工(editing images) 用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区域，然后在imageadvance cropsave crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时在imageadvance cropload crop settings中选定先前保存的名称即可 ） 二 、斑点检测(spots detection) 三 、斑点匹配(Matching spots) Matchset 建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位（position）以便进行匹配（match）。单击工具栏中的match tools图标会出现一个窗口，其中有 landmark, unlandmark, match gel, match all gels等斑点匹配的工具, 在match菜单中也有这些工具。标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要设立两个标志点后便可利用PDQUEST的自动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否匹配上了。 对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能，单击viewinterchange all images, 这样所有的成员胶和参考胶有Gel spot 状态下变成了Gel image, 而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以编辑蛋白质斑点。 四 、数据分析及输出（analysis and report） 比较（Compare）形式有两种，一种是Gel, 可以单个的胶两两互相比较(只能是成员胶和参考胶进行比较)，另一种是Group，可以将同一样品的多块胶做为一组（这在Database Replicate GroupCreate Group下可以创建组），然后再组之间两两比较。然后再选择A 和B，分别表示两块胶或者是两组胶。 在Select Spots Which are 中可以选择Increased, Increased or Decreased 或者是Decreased 等，激活选项后可以输入倍数关系, 默认的是2 times, 可以输入其他数值， 如3 times。参数设好后就单击go, 在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是Increased BA 2 times, 那么这些黄色圈标记的蛋白质斑点即为在量上B大于A 两倍的蛋白质点. 为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点的光密度值比上胶上所有点光密度质而正常化（Normalize）, 单击EditNormalize, 出现一对话框，选择左上角Enable Normalize，下面的窗口被激活，在Basis下选择Total of all Valid Spots, 在Scaling下选择PPM(×1000000), 然后单击?go。这样所有的点都正常化（Normalize）了。 单击Reports 下的Scatter plot，会出现散点图分析的对话框，可以选择x, y轴，分别代表一块胶，Markers 下可以选择倍数，下面的散点图即显示了两个2-D胶图像中蛋白质点之间的相关性，上面会显示二者的相关系数，如果相关系数大于0.4，说明二者有较大的相关性，如果小于0.4大于0.2, 说明相关性较小，小于0.2, 说明没有相关性。在Reports Scatter plots 下可以将所有的凝胶图之