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免疫组织化学 复旦大学上海医学院病理学系 朱虹光 概述 1，免疫组织化学：20世纪70年代 的病理学棕色革命。 2，目的：原位显示待测抗原。 一、组织和细胞标本制备 目的： 1，最大限度地保存组织结构。 2，最大限度地保存抗原性。 注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验目的，参考抗体说明，确定组织处理方式。 （一）石蜡切片 最常用，组织保存最好，易于保存，在大多数情况下优先选用。 1，取材 （1）原则：尽可能新鲜，动物标本可选 用动脉灌注固定。 （2）取材部位：尽量包括病灶和正常组 织交界处，避免选择坏死组织。 （3）避免挤压：受挤压组织不但影响 HE切片的观察，还造成非特异性 免疫组化组织着色。 2，固定 根据不同的染色目的，选择不同的固定液，尽可能采用新鲜组织。切成合适的组织块。 3，制备蜡块 冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋。 4，切片 （1）避免破损，避免切片不平整。 （2）一次性制备足够的连续切片。 （3）避免切片脱落：清洁玻片、涂 胶、切片平整、彻底烘干。 5，衬染 常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。 6，封固和保存 绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用DAB以外的底物进应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油冲液等。 7，保存 1，酶免疫染色切片可保存数周 甚至数月。 2，免疫荧光染色后应尽快观 察、拍照。 （二）常用固定剂 1，醛类： （1）甲醛：常用4%甲醛固定液，最好 采用缓冲甲醛。 优点：结构保存好，组织收缩 少。 缺点：可能对抗原破坏性较强， 造成假阴性结果。 甲醛固定造成假阴性的原因 A，甲醛氧化为甲酸，pH降低。 B，氨基交联形成酸甲基，造成空间 障碍 C，分子间交连掩盖抗原决定簇。 常用固定剂 （2）戊二醛：穿透性好，多用作电镜固 定剂。但对抗原有一定的破坏。 （3）多聚甲醛：效果好，价格昂贵。 2，醇类 （1）乙醇： 优点：固定作用强，抗原保存好。 缺点：组织收缩，变硬。 （2）甲醇：多用甲醇加丙酮，可用于培 养细胞的固定、通透；或冰冻切片 的固定。抗原保存好。 （三）冰冻切片 优点：抗原不受损失。 缺点：不易保存，组织结构保存差，不 易制作连续切片。 1，制备冰冻组织块 （1）干冰丙酮，内置异烷法。 （2）CO2气雾喷冻法。 （3）液氮法。 注：组织需用OCT包埋，置于铝箔中，贮存于-700C冰箱中。 冰冻切片制作及处理 冰冻切片制作：要求同石蜡切片。 切片后处理：一般自然晾干后用冷丙酮固定。 （4）细胞标本制备 1，组织印片：将载玻片轻压于新鲜 的病灶切面上，自然干燥后最好 尽快染色。 2，贴壁培养细胞：可制备爬片。 3，悬浮培养细胞：最好用 CYTOSPIN制作甩片。 （4）细胞标本制备 4，细胞膜通透：因爬片或涂片中细 胞膜是完整的，如果免疫组化染 色的靶抗原为细胞内物质，应先 用50%甲醇+50%丙酮于-200C预冷 后将细胞制片内置20分钟，既可 达到细胞固定的目的，又可完成 细胞膜通透过程。 （五）标本内抗原性的修复 由于固定中抗原性受损，一般在对石蜡切片的免疫组化染色前应对切片进行抗原修复。 （五）标本内抗原性的修复 1，溶解、洗脱变性蛋白 常用的有0.05%~0.1%胰蛋白酶（含0.1%CACL2）；0.1%胃蛋白酶（PH2）。 2，目前最常用者为将切片置于PH6的柠檬酸缓冲液中，微波处理5~15分钟。 二、常用的免疫染色方法和原理 常用的免疫染色法有免疫荧光法，免疫酶法，免疫金银法和放射免疫自显影法。最常用者为前两种。 （一）免疫荧光法 优点：简便、快速，可以定量， 可以用直接法进行双重标 记或多重标记。 缺点：需要荧光显微镜。用于组 织染色特别是石蜡切片组 织染色时常有自发荧光干 扰。 （一）免疫荧光法 最常用的荧光素有： 1，异硫氰酸荧光黄