菌种的复壮与保藏(陈).pptVIP

第三章 菌种的衰退、复壮与保藏 第一节 菌种的衰退和复壮 一、菌种的衰退 菌种衰退（degeneration）是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 （一）菌种衰退的具体表现 1、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。 2、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4、致病菌对宿主侵染能力下降。 5、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。 总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。 （二）菌种衰退的原因 1、基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退 菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 （2）表型延迟造成菌种衰退 如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。 （3）质粒脱落导致菌种衰退 质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。 2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。 3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。 （三）菌种衰退的防治 1、控制传代次数 即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率。 2、创造良好的培养条件 1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。 3）培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子。 4）控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。 3、利用不易衰退的细胞移种传代 在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。 另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。 4、采用有效的菌种保藏方法 有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法。 例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不理想。 短期保藏——一般斜面冰箱保藏法 长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。 对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。 5、讲究菌种选育技术 在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。 6、定期进行分离纯化 定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效防止菌种衰退的方法。 二、菌种的复壮 侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。 广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐步提高。 纯种分离法 寄主体内复壮法 淘汰法 遗传育种法 1、纯种分离法 通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。 “细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。 2、宿主体内复壮法 对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 例如： 苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。 根瘤菌属——