RNA提取中各种试剂地作用.docxVIP

*** *** 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取 RNA 时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。 RNA 提取过程，有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和 RNA 脱离， RNA 进入水相。 氯仿的作用有多个方面，加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主 要用处是用来 分相，实际上是加速有机相和水相的分层。一般的 trizol 试剂在 4度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。离心后混合物分成 三层：下层苯酚 -氯仿层，中间层，上层无色的水样层。 RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为 400ul。【标准： 1mlTrizol 加200ul的氯仿，水样层的容量大约为所加 Trizol 容量的 60% 】 上层水相， PH 5.1 左右，当溶液 pH 在酸性的时候， RNA 分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有 RNA 分子留在水相。而当 pH 接近中性时， RNA 就会溶解在水相，（导致 PH 中性的大概原因是 trizol 与样品比例不对， 应该尽量保证提取量的前提下使 trizol 过量） Trizol 法提 RNA ，加氯仿就是要剧烈震荡才行，这样才能彻底地两相混匀。 异丙醇的作用是通过 -OH 的疏水作用使得 RNA 链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀， 但是这是个反应时发生在水相中， 与前面的氯仿不矛盾。 通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA ， RNA 沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 异丙醇是 沉淀核酸 用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点， 0.6V~1V 就够了，在水相很多， 离心管容积有限， 加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇， 偶尔会有沉淀不出来东西的时候。 【400ul 的水相对应 500ul 的的异丙醇。】 醇沉淀是很经常用的方法，因为 RNA 和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。乙醇沉淀的主要目的是 沉淀 +除盐 。 TRIzol 主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时， 保护ＲＮＡ的完整性 。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA 存在 于水样层中。收集上面的的水样层后， RNA 可以通过 异丙醇沉淀 来还原。 无论是人、动物、植物还是细菌组织， TRIzol 法对少量的组织 (50-100 mg)和 细胞 (5×106)以及大量的组织 (≥ 1 g)和细胞 (107)均有较好的分离效果。 TRIZOL 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完 成。TRIZOL 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。 故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂交、 poly(A)+ 选择、体外翻译、 RNA 酶保护分析和分子克隆。 提取时需要注意一些问题： 提取时要做到超净台内操作、 操作带一次性手套、 EP 管及 Tip 头都要用 0.1%处理（0.1%DEPC 浸泡过夜后，高压蒸气灭菌）、小心、 细致、晃动及每次移液要轻。这样做的唯一目的就是两个，一是小心 RNAse 的污染降解 RNA ；二是动作过度暴力破坏 RNA 的完整性。 另外你提的 RNA 做电泳的问题，一般 RNA 电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以， 需要上样量稍微大些， 并且跑电泳的时间越短越 好（这样也是为了减少外界 RNAse 对 RNA 的降解），跑完电泳立刻观察，这样也可以，但是如果样品中的 RNA 量很低或者说不是很高的话是检测不到的。 因为这些试剂都会影响后续实验 ,所以用酒精洗一到两遍 .一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质 ,二是洗掉异丙醇 ,氯仿试剂 ,酒精的易挥发性 在这里的到运用 , 最后的乙醇主要是洗涤异丙醇， 也可以溶解一部分蛋白， 痕量的乙醇很容易挥发掉。