人类细胞质RNA的提取.pptVIP

人类细胞质RNA提取 RT-PCR的原理、方法 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、 tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%） 组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 分离提纯RNA的目的 分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 RNA的不稳定性 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA 易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活 性，不易失活。 所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性。 由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异。本次介绍的是Trizol法制备RNA。 Trizol法提取RNA Trizol试剂主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细 胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。 苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶 活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β- 巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与 DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通 过异丙醇以沉淀的方式还原。在除去水样层后，乙醇能沉淀 析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 【试剂】 DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙 醇，0.05～0.1％DEPC－H2O，75％乙醇，TE缓冲 液，琼脂糖。 【配制】 1.DEPC水： 1ml＋1000ml双蒸水＝1‰ DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。 2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高压） 基本过程 一、抽提 二、分相 三、RNA沉淀 四、RNA清洗 一、抽提 细胞抽提 1. 组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。 实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥 发将粉末转移到EP管，室温5000rpm离心去上清。 每50-100mg组织，加入1ml Trizol，反复抽吸均匀。 二、分相 3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡 混匀30秒，室温下静置5分钟. 4. 12000 rpm离心15分钟4°C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的 60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。 5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积 约为0.4～0.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。 三、RNA沉淀 6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡30秒混匀。室温下静置10分钟。 7.4°C，离心12000rpm 10分钟。 8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA 沉淀。 四、RNA清洗 9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少用 1ml乙醇清洗DNA),振荡混匀30秒，使沉淀振荡起来， 室温离心12000rpm×1～2分钟。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4℃至少可以保存1周，－20℃至少可以保存1年。 10.室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥 RNA，但不能完全干燥(5～10分钟)。用DEPC水15 μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分钟。 11.测量OD值后，样品放置－70℃保存，一个月 RT-PCR RT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一 种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成 为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 应用 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很 低拷贝数的RNA。广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于 定量监测某种RNA的含量。 基本过程 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶即逆转录酶来完成。 随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。 原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求 RN