抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体.pdf

遗 传 学 报， 11 劝（：34u0-354，工984 Ac.`aGenetica Sinica 抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体 II．抗体 的鉴定 郑永木）‘尚芙蓉“）宁益华“）宋海燕“） 于春海）‘尧素芳2）黄华裸2)庄汉y阑）‘ (I)军事医学科学院微生物及流行病研究所，北京，2)中国科学院遗传研究所，北京） 单克隆C17细胞所分泌的抗炭疽保护性抗原的单克隆杭体，用固相放射免疫、放射性双 扩散及硝酸纤维膜印迹实验，鉴定为阳性，能与此抗原特异地结合。 经 ProteinA-Sepharose CL--4B分离提纯此抗体，再用兔抗鼠标准血清鉴定，其亚型为Igm。将此单克隆抗体偶联到 Sepharose4B上，将炭疽抗原过柱，然后把洗脱液进行电泳分析，证明c17分泌的抗体特异地 针对炭疽保护性抗原中分子量为19,000道尔顿的组分。 前已报道1,〔2)，我们用有限稀释法和集落克隆法建立了斗株分泌抗炭疽保护性抗原单 克隆抗体的细胞株。取其中1株C17的第20代冰冻保存复苏后又传30多代的细胞，对 其分泌的抗体进行免疫学和生物化学的分析。现将鉴定结果报道如下。 材 料 和 方 法 一（）放射免疫双扩散 一般认为单克隆抗体不易形成免疫沉淀线闭，故采用如下 方法：先将单克隆抗体 细（胞培养上清液或腹水）与兔抗鼠Ig的血清 （即第二抗体）在1多 琼脂板上做免疫双扩散，使单克隆抗体与第二抗体结合，形成沉淀线，从而把单克隆抗体 固相化，然后再与 25‘1标记的抗原反应，经漂洗后，干燥，进行放射自显影。 二（）SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳 按照 Laemnill改良法(61做变性与不变性两种条 件的聚丙烯酸胺凝胶电泳。分析抗体时分离胶为10多，浓缩胶为4务；分析抗原时分离 胶为15务，浓缩胶为4外。电极缓冲液为 0.05MTris-0.384M甘氨酸 pll8.3。电压120 V，电流强度30mA。电泳后用两种方法染色： (1)考马斯亮蓝 R250,(2）银染法M［9 以便提高分辨率，把含量极少的组分显示出来。 三（）硝酸纤维膜印迹法41〔 抗原经 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳后，漂洗去掉 SDS, 于凝胶上紧盖一层硝酸纤维素膜，在5倍浓度的 Tris一甘氨酸电极缓冲液中将凝胶上的抗 原带印迹到硝酸纤维素膜上，用压力转移需24-48小时，如用电泳转移，需2小时。取下 膜，先在10mMTrzs-HCIpH7.5-0.9并NaCI-0.1%BSA 中漂洗1小时，再在10mMTris- HClpH7.5-0.9多NaCl-1外BSA 中室温8小时，以饱和膜上的空白位置。然后将膜与单 本文于1983年7月25日收到。 Vz:谢谢胡娟、郑瑜同志提洪炭疽保护性抗原；粱玉梅、郭朝忠同志在放射免疫测定中提供帮助；医科院基础医学 所林嘉友同志协助鉴定抗体类型。 S期 郑永木等：抗炭疽保护性抗原的单克隆杭体 u．抗体的鉴定 349 克隆抗体，一起保温过夜，用10mMTris-HClpH7.5--0.9多NaCl清洗，再加 ’251标记的第 二抗体 兔（抗鼠 Ig),370C3小时，漂洗后于50℃中干燥，做放射自显影。 （四）抗体的纯化与亚类的鉴定[5]［ 用无血清的1640或F12培养基培养的上清 液，或杂交瘤细胞株接种小鼠后收集的腹水，经对0.1M磷酸盐缓冲液 p（H8.0)透析后， 上ProteinA--SepharoseCL-4B柱 I（XIOcm)，用不同的pH梯度 6（.0,5.0,4.0,3.0）的。.I M磷酸盐缓冲液洗脱，各洗脱峰分别用间接血凝法测定效价，收集活性峰，冻千后一 v0c 保存，或作电泳分析或作抗体亚类的鉴定。后者采用Miles公司的兔抗鼠IgG1,坛G2a! IgG2b,IgG3和Igm的抗血清做免疫双扩散实验。 五（）单克隆抗体偶联到 Sepharose4B上亲和层析分离炭疽抗原5)〔 称取所需 量的成品CNBr-Sepharose4B(Pharmacia公司），用 ImMHCl洗，悬浮于偶联缓冲液中 (O.lMNaHC03--0.5MNaCIpH