表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建.docVIP

中国生物工程杂志 　 China B i otechnol ogy, 2008, 28(10 :12~17 研究报告 表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和 酶抑制剂筛选模型的构建 3 张 　 洋 　 刘春平 　 李 　 元 33 (中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所 　 北京 　 100050 摘要 　 表皮生长因子受体 (ep ider gr 属受体酪氨酸激酶 (tyr osine kinase, TK 家族 , 。许多肿瘤的 发生 、 。因此 , EGFR 胞内酪氨酸激酶的抑 。从人脐静脉内皮细胞 (HUVEC 提取总 RNA , 采用 RT 2PCR 获得 EGFR 酪氨酸激酶催化域的编码基因 。 将其克隆至载体 pET 230a, 在 E . coli BL21(DE3 中进行了成功表达 , 采用 N i 2NT A 亲和层析对其进行了纯化 。通过对酶的活性的测定 , 证明重组 EGFR 酪氨酸激酶蛋白具有利用 ATP 催化底物发生磷酸化反应的激酶活性 。以该重组激酶为靶 位构建了酶抑制剂筛选模型 , 拟对微生物代谢产物进行筛选 。 关键词 　 EGFR 酪氨酸激酶 　 克隆表达 　 重组蛋白 　 抑制剂筛选模型 中图分类号 　 Q786 收稿日期 :2008206224　　 修回日期 :2008208204 3国家 “ 863” 计划 (2004AA2Z3784 资助项目 33通讯作者 , 电子信箱 :yuanwli@263.net 　　 EGFR 广泛分布于哺乳动物的上皮细胞 、 人的成纤 维细胞 、 胶质细胞 、 角质细胞等 , 并在多种上皮肿瘤细 胞中过度表达 [1] 。 EGFR 高表达的肿瘤患者 , 肿瘤恶性 程度高 , 患者存活期短 [2] 。人的 EGFR 基因定位于第 7 号染色体的短臂 (7p12. 32p12. 1 , 它 的 编码 产 物由 1210个氨基酸组成 , 是一种分子量约为 170kDa 的糖蛋 白 , 由胞外结构域 、 跨膜区及胞内结构域组成 [3] , 其中 712~979位氨基酸属于酪氨酸激酶区 [4] 。 EGFR 酪氨 酸激酶能催化 ATP 的 γ磷酸基团转移至许多重要蛋白 质的酪氨酸残基上 [5] , 使其发生磷酸化 , 进而导致信号 的传导级联 。 据了解 50%以上的原癌基因和癌基因产 物都具有蛋白酪氨酸激酶活性 , 它们的异常表达导致 细胞增殖调节发生紊乱 , 进而促使肿瘤发生 [6] 。因此 , 以 EGFR 2TK 为靶位进行药物设计和筛选可能成为肿 瘤治疗的有效途径之一 。 　　 本研究将人源 EGFR 酪氨酸激酶催化域在 E. oli BL21(DE3 中成功进行了表达 , 采用 N i 2NT A 亲和层析 对蛋白进行了纯化 , 并对重组蛋白的酪氨酸激酶活性 进行了优化条件研究 , 以其为靶点构建了酶抑制剂筛 选模型 , 对微生物产物进行筛选 , 为抗肿瘤新药的研制 奠定了一定基础。 1　 材料与方法 1. 1　 材 　 料 1. 1. 1　 质粒 、 菌株和细胞株 　 质粒 pET 230a 及大肠杆 菌 BL21(DE3 由本室保存 , HUVEC 细胞由本所肿瘤室 保存。 1. 1. 2　 酶与主要试剂 　 限制性内切酶、 T4DNA 连接 酶、 pfu DNA 聚合酶购自 Pr omega 或 TaKaRa 公司 ; 抗 H is 2tag 的单克隆抗体 、 磷酸化的酪氨酸单克隆抗体购 于 Santa crunz 公司 ; 山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的二 抗购自中山试剂公司 ; Hepes, 合成肽底物 poly (Glu, Tyr 4∶ 1和 Na 3VO 4购自 Sig ma 公司 ; TR I zol 为 I nvitr ogen 2008, 28(10 张 　 洋 等 :表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建 公司 产 品 ; NBT/BCI P 购 自 Pr omega 公 司 ; IPTG 购 自 MERCK 公 司。 UN I Q 210柱 式 DNA 胶 回 收 试 剂 盒 (Sangon 公司 。 1. 2　 方 　 法 1. 2. 1　 EGFR 2TK 基因的获得和重组质粒 pET 230a / EGFR 2TK 的构建 　 采用 TR Izol 试剂从人脐静脉内皮 细胞 (HUVEC 提取总 RNA 。采用两步法 RT 2PCR 试 剂盒 (TaKaRa , 以 O ligo (dT 2adap tor 为 RT 引物进行 反转录 , 反应条件为 :30℃ 10m in, 42℃ 30m in, 99℃ 5m in, 10℃ 5m in 。根据已知的 EGFR 2TK 基因序列设 计引物