《第五章氨基酸、蛋白质提取工艺特性》.pptVIP

第五章 氨基酸和蛋白质提取工艺特性;一、氨基酸的特性; 氨基酸在适当的条件下，能进行有机胺或有机酸的几乎全部反应。与一般的酸和碱可生成稳定的盐，大部分均能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制成的络合物不溶于水，也可利用这种性质来分离氨基酸。;二、氨基酸的浸出;三、氨基酸的分离;②成盐分离法:利用某些酸性氨基酸与某些金属化合物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，或某碱性氨基酸与一般酸生 成盐，从而与其他未成盐的氨基酸分离。如南瓜子中的南瓜子氨基酸是通过与过氯酸生成结晶性盐而分出的。 ③晶析法:利用不同氨基酸等电点不同，进行晶析结晶分离。例如在含有亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的溶液，其pH值为1.5～2.0时，浓缩先晶析出亮氨酸，它的母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮氨酸，最后母液中回收缬氨酸。 ;四、氨基酸、肽的鉴别反应 ①茚三酮(Ninhydrin)反应：所有的a-氨基酸及含有a-氨基酸的肽类和蛋白质都能和该试剂反应呈现兰色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上进行。 (2)吲哚醌(Isatin）试剂反应：不同的氨基酸与吲哚醌试剂反应，能显示不同的颜色。由于试剂的配制方法不同，对同一种氨基酸所显示的颜色也往往有差异。吲哚醌不仅可用于氨基酸的显色，而且从其颜色的区别，可以帮助辨认氨基酸。显色不稳是其特点，氨对显色无干扰。 ;第二节 蛋白质提取工艺特性 ;蛋 白 质 类 别;二、蛋白质及酶的一般提取方法;(1)盐浓度：提取蛋白质的盐的浓度，一般在0.02～0.2M的范围内。常用稀溶液和缓冲液有0.02～0.05M磷酸缓冲液，0.09～0.15M氯化钠溶液。 (2)pH值：蛋白质和酶所用的提取液pH值一般选择在被提取的蛋白质等电点两侧的稳定区内。 (3)温度：蛋白质和酶一般都不耐热，所以提取时通常要求低温操作。;2.有机溶剂提取;有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下，采用稀的有机溶剂提取常常是为防止水解酶的破坏，并兼有除杂和提高纯化效果的作用。;3、从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法 膜上的蛋白质或酶一般有两种存在状态，一是在膜表面上，与膜成分联系比较松；第二是膜的内在成分之一，或与膜成分结合较紧。蛋白质与膜成分的结合可通过脂质形成复合物，也可以通过金属离子与膜成分结合，或与膜其他蛋白质形成复合物。与膜成分结合较松的蛋白质或酶，经过充分破碎细胞，在一定pH范围用稀盐溶液即可提取分离。但一些与膜成分结合较牢或属于膜组成的蛋白质，提取则比较困难，须用超声波、去污剂或其他比较强烈的化学处理，才能从膜上分离出来。主要方法有：;(1)浓盐或尿素等溶液提取 如NaClO4、尿素、肌盐酸等溶液均有人应用于提取膜蛋白，当以上溶液浓度达到2mol/L时，可提取27％以上的膜蛋白，但使用这样条件易引起蛋白质和酶的变性。 (2)碱溶液提取 碱性条件也可以解离与膜上成分结合的蛋白质。在pH8-10范围内，某些膜蛋白随着pH的提高而溶解度大大增加，至pHll时，有40%-50％的膜蛋白被抽出，但碱提取法也容易引起蛋白质和酶的失活，应用上不广。 (3)加人金属鳌合剂 蛋白质通过金属离子与膜成分结合时，加人金属鳌合剂如EDTA可使蛋白质释放出来。用此法曾成功地提取了膜上ATP酶的偶联因子I 。EDTA与超声波联合处理抽提膜上的磷酰转移酶效果更好。;(4）有机溶剂抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上与脂质结合的脂蛋白或膜内脂蛋白组分最常用也较有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜内脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛的pH (pH3-10)和温度范围（-2—40℃）内使用。用有机溶剂结合其他方法已成功地提取了多种膜上蛋白质和酶，如NPDH脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。;(5)去垢剂处理 去垢剂处理是目前广泛应用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用的去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸盐，强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS）和非离子型去垢剂Triton X-100和Tween, Lubrol和Brij等。 去垢剂处理膜蛋白时的浓度通常为1％左右，用此法提取的膜蛋白和酶有细胞色素BS、胆碱醋酶、细胞色素氧化酶、DPNH氧化酶、ADP/ATP载体蛋白等。;用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：①去垢剂的溶解能力；②去垢剂的温和性。强离子型去垢剂（如SDS)一般具有很好的溶解能力，但温和情况不理想，容易引起蛋白质变性。弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小，而溶解能力差。去垢剂的溶解能力与溶液的离子强度大小有关。一般来说，离子强度增加，去垢剂的溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解膜蛋白时，须考虑各种条件。根据Klinge