第二章-液相色谱分析.pptVIP

高效液相色谱 第一节 概述 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段。 二、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测。 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别。 2．流动相差别： GC：流动相为惰性气体。组分与流动相无亲合作用力， 只与固定相作用。 HPLC：流动相为液体。流动相与组分间有亲合作用力， 为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对 分离起很大作用。 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用。 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相。 可以增大分离选择性。 三、HPLC的特点和应用 “三高” “一快” “一广” 第二节 基本理论 二 速率理论 GC: H=A+B/U+CU(填充柱) H=B/U+CU(毛细管柱) HPLC: H=A+CU B=2γD,对于HPLC，因Dm较小，B项可忽略 三、HPLC法分离条件的选择 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定（dp≤10μm）。 首选化学键合相，匀浆法装柱。 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相。 3. 柱温的选择： 选室温25℃左右 第三节 高效液相色谱仪 液相色谱仪： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 仪器构造图 1高压输液系统 高压泵 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。还应耐腐蚀，密封性好。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化。有机械注射式和机械往复式两种。每分钟往复25~100次，脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。 在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱，脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘溢，噪音增加,也可采用超声脱气和真空脱气 。 梯度淋洗装置 在分离过程中通过不断地变化流动相的强度(极性、pH或离子强度 )，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。 2．进样装置 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好。 3．色谱柱 一般直径2－6mm,柱长10－30cm, (尺寸排阻色谱柱常大于5mm；制备色谱柱内径更大，可达25mm以上)。 4．检测器 1、紫外检测器：适于吸收紫外光的物质。 2、示差折光检测器：利用折光率的差别， 灵敏度低，温度要求严格（要使用柱温箱）。 3、荧光检测器：只能分析自身发光的物质， 灵敏度高。 4、电化学检测器。 5、其它检测器：MS、IR、光散射、极谱。 紫外检测器 其检测原理采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm，体积约为1~10 ?L HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最小吸收波长。 示差折光检测器： 原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。 为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。 荧光检测器 许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的荧光活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。 电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。 第四节 HPLC流动相和固定相简介 一