真菌漆酶工程和其在有机合成中应用.docxVIP

真菌漆酶工程和其在有机合成中应用 摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于 真菌，高等植物及细菌中。由于漆酶反应条件温和并具有广 泛的专一性，被认为理想的绿色催化剂。综述通过合理设计 和定向改造真菌漆酶及漆酶工程并运用于有机合成领域的 研究。 关键词：漆酶催化剂有机合成 中图分类号：Q554. 9文献标识码：A文章编号: 1007-3973 (2013) 003-078-03 漆酶是一种含铜的蛋白酶，通过夺取底物一个电子能够 催化酚类、多酚类和苯胺氧化，通过电子传递将氧气还原成 水。漆酶和漆酶介质体系在生物修复、纸浆漂白、纺织品生 物整理和生物燃料电池等方面都有潜在的应用。值得注意的 是，漆酶具有在官能团的氧化与将异源分子连接到新的抗生 素衍生物之间执行快速精密的转化的功能，或者催化合成复 杂天然产物的关键步骤，因此可用于有机合成领域。 1漆酶的性质 1. 1生化特征 漆酶是含有四个铜原子并与三个氧化还原位点（Tl, T2 和T3）相结合的典型单体胞外酶。T1型Cu在氧化还原测试 中呈现绿色，与还原性底物的氧化作用有关。三核簇（含有 一个T2型Cu和两个T3型Cu）与T1位点相距12A,分子氧 在此处被还原成水。 在不同的培养条件下，真菌合成漆酶会出现不同的同工 酶。大多数漆酶都是单体蛋白，不同来源的漆酶其分子被不 同程度的糖基化，平均分子量在60-70kDa,碳水化合物含量 在10-20%,这有助于漆酶的高稳定性。通常与酶通过共价键 相连的碳水化合物包括甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖。氨 基酸链含有包括N-末端分泌肽在内大约含有520-550个氨基 酸。 1.2生物学功能与工业应用 漆酶生物学功能包括胞子抗病性，色素沉着，选择性的 催化木质素降解，腐殖质脱毒过程等。漆酶具有广泛的底物 专一性，因此广泛应用与生物技术中。在小分子介质存在的 情况下，漆酶能显著增强其底物专一性。通过使用漆酶介体 体系可能扩宽漆酶工业应用的范围。例如，漆酶和漆酶介体 体系已经应用于纸浆造纸中的脱木质素和生物漂白，发电站 废水处理，纺织和染印工业中纤维素酶学修饰和染料漂白， 酶法交联木质素材料生产中密度纤维板等。 在有机合成中，漆酶广泛用于官能团的氧化，酚类和辎 类化合物的耦合，碳-氮键的构建以及复杂天然产物的合成 中。 2漆酶介体体系 漆酶与小分子如ABTS和HBT的结合不仅会具有更强的 催化氧化还原能力，而且会扩大漆酶对底物的作用范围，并 能够氧化氧化还原势能比其更髙的化合物。此外，小分子介 质作为电子载体，能够氧化木质素，纤维素或淀粉等生物高 分子。由于氧化还原介质的作用，克服了阻碍酶与多聚物间 的直接影响的空间结构的影响。 漆酶介体体系给生物技术和环境应用带来较高的效率。 选择合适的介质在生物转化应用中是至关重要的。由于漆酶 介体体系中底物通过不同的机制发生氧化，因此使用相同的 前体时，不同介质的选择可能导致不同的终产物。介体自由 基根据化合物的结构和有效的氧化还原势能执行具体的氧 化反应。 尽管漆酶介体体系有较大的优势，但是以下两点阻碍了 介质的使用：介体价格昂贵并会产生有毒的衍生物。在某些 情况下，由于介质自由基的存在，漆酶在氧化介质时是不显 示活性的。或者后者转化为无活性的化合物并失去充当介质 的能力。因此寻找一种廉价高效、应用面广的介体将是LMS 系统处理技术得以推广应用的关键。研究表明，一些真菌能 自然合成天然的介体。例如苯酚，苯胺，4-对務甲基苯甲酸, 4-餐基苯甲基醇。最近，人们证明来自木质素降解过程中的 酚类化合物（如乙酰丁香酮，丁香醛，香草醛，香草乙酮， 阿魏酸，p-香豆酸）在染料脱色，多环芳炷的去除，纸浆漂 白和沥青的去除中是高效的漆酶天然介体。 3漆酶工程 迄今为止，很少有报道关于活性漆酶的晶体结构。根据 已报道的漆酶结构，过去十年研究对具有催化活性的铜离子 周围一些残基进行定点突变，以确定催化活性参数和真菌漆 酶势能。收集在T1铜原子中心发生结构混乱的突变体是这 些结构功能综合研究的结果之一。 在没有足够结构信息的情况下，分子定向进化能克服许 多合理设计中的限制因素，并能显著增强有针对性的特征， 例如耐高温和有机溶剂，提高催化活性及专一性等。Arnold 等首次成功定向漆酶进化，通过定向进化在毕赤酵母中完成 了耐热性漆酶的功能性表达：经过10轮实验室进化和筛选, 总体酶活提高了 170倍并具有更好的耐热性。 大多数漆酶在有机合成中催化转化必须发生在有机溶 剂中。漆酶在高浓度有机助溶剂中会失去活性。Adinarayana Kunamneni等经过5轮定向进化在毕赤酵母中表达出一种耐 热性漆酶，并能耐高浓度的有机助溶剂。这种进化的漆酶突 变体能够抵抗大量与生物技术有关的浓度高达50%的可溶性 助溶剂。固有的电化学漆酶