实验5 原位杂交.pptVIP

核酸分子杂交技术;实验对象：海蜇胚胎-横裂体和碟状体;杂交技术的原理;;1、模板的制备;目的片段克隆到载体(pGEM-pEasy) 将PCR产物与pEasy-T3连接，连接是非定向的，需要测序确定连接的方式。;A、质粒提取（彻底抽提蛋白，避免有机溶剂残留） B、酶切（酶切位点的选择原则）： 使合成的探针长度在200bp-1000bp； 尽量选常见的酶；分清编码链和模板链。 C、酶切产物的回收 胶回收或沉降回收（回溶或洗脱时要用DEPC处理的水，切勿混入超过0.1M的EDTA）。;体外转录合成反义探针的模板（原位杂交所用的探针）是DNA的编码链 体外转录合成正义探针（原位杂交中的阴性对照）的模板是DNA的模板链;5’;2、体外转录;配制新鲜电泳缓冲液TAE和琼脂糖胶，以降低RNA的降解速度。 点DNA marker估计其分子量。 ;体外转录法合成RNA探针;5、探针效率测定;体外转录法合成RNA探针;探针制备中的关键问题;实验方法;实验方法;实验方法;实验方法;实验方法;实验方法;实验方法;海蜇补体系统相关基因wnt3在海蜇胚胎中原位杂交;杂交中的关键问题;Trouble shooting;Trouble shooting;实验操作;;7)洗涤。 (1)小心除去抗体，用MAB 洗4 遍，室温每次30min，摇动使洗涤充分。 (2)换用TM