蛋白质一级结构及一级结构分析.ppt

氨基保护基Y：Cbz、Boc、Tos 羧基保护基Z：甲酯（OMe）CH3O- 乙酯（OEt）C2H5O- 苄酯（OBzl） 叔丁酯（OBut） 缩合剂：N，N′一二环己基碳二亚胺（N，N′-dicyclohexyl carbodiimide，缩写DCCI或DCC） 脱去氨基保护基的方法： Boc用酸，如50%三氟醋酸脱去 Tos用钠氨还原法 脱去羧基保护基的方法： 苄酯（OBzl）用催化加氢法 叔丁酯（OBut）用酸，如50%三氟醋酸脱去 Cbz用催化加氢法 甲酯或乙酯用皂化法 ② 将参与肽键合成的羧基和氨基活化 羧基的活化: 氨基的活化： 接肽时加入有机碱如三乙胺或KHCO3等，保证氨基处于自由状态，氨基即活化。 早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现在用了最多的是活化酯法和混合酸酐法。 液相合成的优缺点 （2）固相合成法 3．多肽抗菌素 4．多肽激素 5．神经肽 甲硫氨酸脑啡肽 Tyr–Gly–Gly–phe- Met 亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能：镇痛 如脑啡肽 (enkephalin) α－鹅膏蕈碱 第四节 蛋白质一级结构及一级结构分析 当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质。 蛋白质与多肽的主要差别：分子量，空间结构 （一）蛋白质的一级结构（primary structure） 1．定义： 蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（sequence），一级结构的主要连接键是肽键。 2．蛋白质一级结构的测定 概况 : 序列测定前的准备工作： 样品的纯度 相对分子质量 肽链的数目 氨基酸组成 一级结构的测定主要用小片段重叠的原理 蛋白质测序的策略： 测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链 断开多肽链内的二硫桥 分析每以条多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的N—末端和C—末端残基 裂解多肽链成较小的片段 测定各肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构 确定半胱氨酸残基间形成的S—S交联桥的位置 序列测定方法 （1）末端分析：包括N端分析，C端分析 N端分析方法 ① 二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法） ② 丹磺酰氯法（DNS法） ③ 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 ） ④ 氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法 Ala Val Gly 亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase, LAP） 专一性: A=非极性氨基酸时 快 A=其它氨基酸时 慢 A B N端 A=Leu时 最快 N端氨基封闭的几种情况 ： 乙酰化、焦谷氨酰环化、环状肽等。 C端分析 ① 硼氢化锂还原法 ② 肼解法：也称联氨法 苯甲醛的作用 ③ 羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法 4种羧肽酶的来源和专一性 羧肽酶 来源 专一性 CpA 胰脏 能释放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸 CpB 胰脏 主要水解C端为Arg或Lys的肽键 CpC 植物或微生物 相当广泛，几乎能释放C端的所有氨基酸 CpY 面包酵母 可释放C端所有氨基酸 （2）肽链的拆开和分离 共价键 非共价键 （3）氨基酸组成的分析 完全水解： 酸水解 碱水解 （4）肽链的部分水解 化学方法： 溴化氰（CNBr）裂解法: 羟胺裂解法： 专一性地水解Asn－Gly之间的肽键，但专一性不强， Asn－Leu， Asn－Ala也能部分裂解。 酶解方法 （5）肽段的分离和氨基酸序列测定 分离：层析，凝胶电泳，HPLC,凝胶过滤等 序列测定： Edman化学讲解法（PITC),DNS-Edman测序法 酶降解法（氨肽酶、羧肽酶） 质谱法 根据核苷酸序列的推定法 （6）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列 （7）二硫键位置的确定 对角线电泳 用胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白质 3．蛋白质测序举例 insulin 近年来由于DNA序列的测定发展很快，可将相应于蛋白质的DNA序列测定出来后，推出蛋白质的序列，为蛋白质一级结构的测定带来了新的曙光。 一级结构测定展望 4．蛋白质序列数据库 (1) PIR（Protein Information Resource）数据库 (2) SWISS-PROT数据库 （二）肽的人工合成 1．概况 20世纪初 E. Fischer：以氨基酸为原料合成了一个十八肽。 1932年 M.Bergman: Cbz 1953年 美国 Du.Vignea