卢大儒-基因测序原理与应用.pdfVIP

基因测序的原理及应用 卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室 上海市遗传学会 drlu@fudan.edu.cn 大 纲 一、第一代测序技术的原理、发展和应用 三、下一代测序技术的诞生、发展和应用 三、第三代测序技术与展望 DNA发现与测序技术的发展主要时间表 第一代测序技术的诞生、发展和应用 一、第一代DNA测序原理 DNA sequencing Walter Gilbert Frederick Sanger • 1975 DNA sequencing developed: Walter Gilbert and Allan Maxam of Harvard University and Fred Sanger of Cambridge University simultaneously come up with two techniques for determining the exact sequence of bases that make up a gene. Gilbert and Sanger share the 1980 Nobel Prize). 测序方法 • 化学裂解法 Maxam-Gilbert (chemical) sequencing • 末端终止法 Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing • DNA序列测定技术，是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳技术的基础上建立起来的。变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳能够分离长度达到300～500个碱基，而差 别仅1个碱基的单链寡聚核苷酸。 • 技术由三部分组成 1 产生不同长度的DNA片段,差别仅1个碱基。 2 在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。 3 测序胶的放射性自显影技术。 末端终止法原理 • 使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基 特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差 一个核苷酸的单链DAN等3种方法。当反应遇到双脱氧的 核糖核苷酸底物（ddNTP）时，掺入到新生的DNA链中， 但是该双脱氧的核糖核苷酸的掺入阻止了DNA链进一步 的延伸反应，形成了长短不同的DNA片段。通过电泳和 放射自显影读出DNA序列。 DNA聚合酶（DNA polymerase）是DNA复制 DNA的重要作用酶。DNA聚合酶, 以DNA为复 制模板，从将DNA 由5端点开始复制到3端的 酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成 （在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及 DNA复制过程 其相辅的活性。 DNA 合成的底物 deoxynucleoside 5’-triphosphates dNTP (dATP, dGTP, dCTP TTP)    dATP PPi (pyrophosphate) 3’-5’ phosphodiester bond or diphosphate DNA sequencing