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Sanger测序的基本原理、过程 注意事项 热烈欢迎莅临参观指导 广州金域分子病理：罗锦霞 2014.12.31 内容提要 一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题 3,5-磷酸二酯键 5’ 磷酸 脱氧核糖核苷酸通过形成3’，5’-磷酸二酯键延长DNA的链 化学原理：双脱氧末端终止法 无3’ OH 的ddNTP阻止下一个dNTP 的掺入 测序PCR的过程 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系 列不同长度的新的DNA片段。 内容提要 一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题 Sanger测序的基本操作流程 ExoSAP-IT 酶纯化 大约40分钟 配制测序PCR体系进行测序PCR反应 大约2小时 测序PCR产物的纯化 大约1小时40分钟 上机进行测序分析 ExoSAP-IT 酶纯化 ExoSAP-IT酶是一种复合酶，包括两种水解酶：外切酶 Exonuclease I 和虾碱性磷酸酶 虾碱性磷酸酶 残留的引物及任何在PCR Exonuclease I 中产生的外来单链DNA 配制测序PCR体系进行测序PCR反应 Reaction 1/8x 1/16x DNA 1u 1u 引物 (3.2 pmol/μL) 1u 1u BigDye (2.5x) 0.5u 0.25u Seq Buffer (5x) 1.75u 1.875u 去离子水 5.75u 5.875u 总体积 10u 10u BigDye的终浓度：(2.5x ×0.25 μL + 5x ×1.875 μL ) / 10 μL = 1x 测序反应完成后存在什么？ 荧光标记的测序产物 残留的荧光标记的ddNTP 为什么要进行测序产物纯化？ 1、测序反应只消耗一小部分荧光标记的ddNTP(BigDye® Terminator ） 2、残留的BigDye会随测序产物一起进入毛细管迁移，导致错误的碱基判 读 测序PCR产物的纯化 酒精/EDTA/NaAc法 • 每管加入1 μL 125 mM EDTA(pH=8)，1 μL 3 M NaAc(pH=5.2)，加到管底； • 加入35 μL 100% 酒精，封严，震荡4次，室温放置15 min； • 3700rpm 4 °C离心30 min，马上倒置96孔板， 离心至850rpm停止离心； •