全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定.docVIP

ＲｅｓｅａｒｃｈＰａｐｅｒｓ 生物化学与生物物理进展 研究报告 ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ２００８，３５（８）：９４７￣９５３ ｗｗｗ．ｐｉｂｂ．ａｃ．ｃｎ 全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的 构建与筛选鉴定＊ 肖 艳 李官成＊＊ 李跃辉 黄 建 童永清 张志杰 （中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，长沙４１００７８） 摘要体外致敏并用ＥＢＶ转化肝癌患者的ＰＢＭＣ．用ＰＣＲ分别扩增ＶＨ和ＶＬ基因并组成ＳｃＦｖ基因．将ＳｃＦｖ基因与载体 ｆｕｓｅ５连接后，电击转化大肠杆菌ＭＣ１０６１，构建噬菌体呈现型ＳｃＦｖ库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及ｐｈａｇｅ－ＥＬＩＳＡ筛选．筛选获得的阳性克隆进行ＥＬＩＳＡ及免疫组化鉴定并测序．结果表明，经ＥＢＶ转化的４例肝癌患者ＰＢＭＣ，ＥＬＩＳＡ检测均有抗肝癌抗体产生，经多次ＰＣＲ，扩增出６种ＶＨ（γ、μ）和９种ＶＬ（κ、λ）基因，经连接组成５４种ＳｃＦｖ基因．将ＳｃＦｖ基因与载体连接后，导入大肠杆菌ＭＣ１０６１，得到库容为１．０×１０８的初级噬菌体抗体库，全长ＳｃＦｖ基因的插入率为８０％．用人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２和人肝细胞系ＱＳＧ－７７０１对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从中随机挑取５３３个克隆进行ＥＬＩＳＡ筛选，得到１７９个阳性克隆，阳性率为３３．６％．将１７９个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定，发现克隆Ａ８２对肝癌细胞系ＨｅｐＧ２、人胚肾上皮细胞系ＨＥＫ２９３呈强阳性反应，免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应，而不与正常肝组织反应．且Ａ８２的相对亲和力为２．４ｍｏｌ／Ｌ，解离常数Ｋｄ为５．３２×１０－９ｍｏｌ／Ｌ，显示其亲和力较高．对克隆Ａ８２进行测序分析，结果表明：Ａ８２全长７４２ｂｐ，含ｌｉｎｋｅｒｃＤＮＡ序列４５ｂｐ，重链可变区基因与人胚系ＩｇＶＨ３－２３有９４．３％的同源性，轻链可变区基因与人胚系ＩｇＶ４－２有９４．９％的同源性，Ｖ－Ｄ－Ｊ分别属于ＶＨ３－２３－Ｄ２－２１－ＪＨ６－１０８ｌｉｎｋｅｒ－Ｖ４－２－ＪＬ２．由上述结果可见，应用体外抗原致敏方法和ＥＢＶ转化技术联合噬菌体抗体库技术，构建了库容量达１×的全人源抗肝癌单链抗体库，通过细胞ＥＬＩＳＡ和免疫细胞化学鉴定，获得的噬菌体抗体克隆Ａ８２具有较强的特异性，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础． 关键词 ＥＢ病毒转化，噬菌体抗体库，肝癌，单链抗体 Ｒ７３９．６３ 学科分类号 肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤，其治疗仍以手术切除为首选，但复发率极高，加上肝癌早期多无临床症状，绝大部分发现时已属于中晚期，丧失了手术时机，化疗药物应用于人体又会导致很大的副作用．单克隆抗体以其特异靶向性在临床放射免疫诊断和导向治疗方面有较大的应用价值［１，２］，但也存在诸多缺陷，制约了其在临床的应用．ＳｃＦｖ弥补了传统单克隆抗体（ｍＡｂ）制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足，可望成为肝癌放射免疫诊断和导向治疗的有力工具．本研究拟解决鼠源性单抗用于导向治疗穿透力低及易产生人抗鼠抗体反应等难题，采用体外致敏法和ＥＢＶ转化技术联合噬菌体展示技术构建全人源的抗肝癌ＳｃＦｖ库，并进一步筛选获得高亲和力的抗肝癌ＳｃＦｖ，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定基础． １ １．１ 材料和方法 材料 丝状噬菌体ＦＵＳＥ５，Ｋ８０２、ＭＣ１０６１大肠肝菌菌株均由本室保存．绒猴淋巴母细胞系Ｂ９５．８，肝癌细胞株ＨｅｐＧ２，鼻咽癌细胞系ＣＮＥ２，大肠癌细胞系ＨＲＴ－１８，宫颈癌细胞系Ｃａｓｋｉ，肺癌细胞系Ａ５４９，及人类正常细胞肝细胞系ＱＳＧ－７７０１，人胚肾上皮细胞系ＨＥＫ２９３，骨髓间质干细胞ＨＢＭＳＣ，原代培养的脐静脉内皮细胞ＨＵＶＥＣ等 ＊湖南省卫生厅科研基金重点项目（Ａ２００３００１）．＊＊通讯联系人． Ｔｅｌ：０７３１－４８０５４４５，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｂｓｕｎ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｃｓ．ｈｎ．ｃｎ收稿日期：２００８－０３－２９，接受日期：２００８－０５－２９ ?９４８? 生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００８；３５（８） 均由本室保存．胎牛血清（ＦＣＳ）及小牛血清（ＮＢＳ）为杭州四季青公司产品．ｒｈＩＬ－２、谷氨酰胺、丙酮酸钠及环孢菌素Ａ均为Ｓｉｇｍａ公司产品．ＲＰＭＩ１６４０、琼脂糖和细菌培养基，均购自Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ公司．ＴＲＩｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品．ｃＤＮＡ合成试剂盒为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品．ＰＣＲ产物纯化试剂盒，小量质粒抽提试剂盒购自长沙赢润生物技术有限公司．ＳｆｉⅠ限制性内切酶为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品，ＴａｑＤＮＡ酶和Ｔ４ＤＮＡ连接酶为华美生物公司产品．ＨＲＰ标记的羊抗人ＩｇＧ／Ｍ购自ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公司．３０份肝癌患