蛋白质分离与纯化.pptVIP

福林—酚试剂法： a 福林—酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和 磷钨酸的混合试剂 b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应 c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸 还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质 成正比。 2、蛋白质纯度的鉴定 常用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法 高纯度：电泳得到均一的一条区带 低纯度：电泳得到几条区带 1、名词解释： 蛋白质的两性解离 蛋白质的等电点 蛋白质的凝固 蛋白质沉淀 蛋白质变性 2、简答题： 简述维持蛋白质胶体稳定性的因素及原理？ 简述导致蛋白质沉淀的因素？ 蛋白质的变性的本质？ 简述导致蛋白质变性的因素？ 变性蛋白质的理化性质有哪些改变？ 简述蛋白质的沉淀、变性和凝固之间的关系？ Thanks 6、蛋白质的凝固作用(protein coagulation)： 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 注意：凝固后的蛋白质一定是变性的，并一定出现沉淀现象。 （四）蛋白质的分子大小 蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达4千万（烟草花叶病毒）。 目前常用的测定蛋白质分子量大小的方法包括：扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤、渗透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 1、根据化学成分，测定最小相对分子质量： 利用化学分析，定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低相对分子质量（Mr） 如：用化学分析法，测定血红蛋白质中含Fe 0.34％，则 最低 Mr=55.84×100/0.34=16700； 用其它方法测定，其实际Mr为16700的4倍，由此可知，血红 蛋白含有4个Fe的原子，而不是1个 Fe。 2、超离心法： 在60 000～80 000r/min 的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。 超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 转头 转头腔 沉降样品 驱动马达 真空 冷冻 沉降系数：是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。 一个S单位，为1×10-13秒。 相对分子质量越大，S值越大。 蛋白质的沉降系数：1～200S。 超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离纯化蛋白质。 s = ———— v ω2x v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm） 知道了沉降系数S，可根据斯维得贝格 〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D〔1－iρ〕 R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ρ：溶剂的密度 3、凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的洗脱液体积。 测定样品蛋白质分子量的方法： ① 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕； ② 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线； ③ 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕； ④ 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。 4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶：单体—丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂—N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, 简称PAGE）. SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状） ★ 此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量. 方法： ① 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理,蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS