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动物细胞工程应用 动物细胞的培养过程 有关概念 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养） 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 有关概念 动物组织细胞培养要求 一 体外培养特点: 大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。 二 培养工具: 培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。 　根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。 　　  三、培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 【讨论】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。 1）恒定的温度:37 ℃， 　　维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复； 在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复； 41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能； 当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低 2）PH：7.2-7.４ 当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 用来检测PH的变化：红色--pH7.4， 橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。 3) 气体： ＣＯ２有调节PH的作用。 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。　 4）营养—培养基： 在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。 动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。 氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。 水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。 5) 细胞培养溶液 平衡盐水（BSS）： Hanks 液和Earle液是常用的BSS基础溶液。 PH调整液： NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸） 细胞消化液: 胰蛋白酶溶液．EDTA溶液．胶原酶溶液 抗生素溶液： 1)青、链霉素:每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素. 2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。 3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。 6)、无污染环境 　　培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。 四 细胞培养设施 　　1、实验室设计　　细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。 细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。 细胞培养实验室 1.准备室 2.缓冲室 培养室 专用于组织