生物样品方法学验证及数据处理.docVIP

摘要 目的:建立体内含量测定方法学,规范数据处理。 适用范围:体内实验,酶实验等。 1仪器试剂 1.1仪器 涡旋仪,20ul、200ul、1000ul移液枪,高速离心机,氮吹仪 1.2试剂 甲醇、乙腈(色谱纯 2操作规程 2.1溶液配制 2.1.1内标溶液配置(假设需加入20ul内标液的浓度为50ug/ml 将储备液浓度稀释到40ug/ml 2.1.2标准曲线浓度配置 假设血药最大浓度为30ug/ml,则设标曲血药最大浓度为60ug/ml 血药浓度设定点为:60,30,12,6,2.4,1.2,0.48,0.24ug/ml 10ul药物浓度为:600,300,120,60,24,12,4.8,2.4ug/ml(若吸收值比较大,继续逐级稀释,最低点测不到可减少浓度点 对应的序号为:1,2,3,4,5,6,7,8(稀释规律为1稀释两倍为2,1稀释5倍为3,2稀释5倍为4,3稀释5倍为6,一次类推;在设定QC浓度时通常2号定为高浓度,中浓度一般选择标准曲线中间浓度可以选择4号或者5号,低浓度通常选择7号,标准曲线最低点即8号为最低定量限浓度(LLOQ 2.1.3加入的20ul药液配置 取内标溶液(40ug/mlX ul,再取同体积的配置的10ul药物浓度混合后即得。2.2实验步骤 2.2.1所需要处理的样品及具体细则: (1处理标准曲线样品三套(随行空白样品 编号:1-1,1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7,1-8;1-kb 2-1,2-2,2-3,2-4,2-5,2-6,2-7,2-8;2-kb 3-1,3-2,3-3,3-4,3-5,3-6,3-7,3-8;3-kb 操作:EP管加20ul药液(内标+药物,再加入空白血浆,沉淀蛋白,取上清液氮气吹干,复溶,进样(开始时进一套标曲,中间进一套标曲,最后进一套标曲。 (2处理QC样品(高、中、低、LLOQ样品,每个浓度5份/天,连续处理三天 编号:1高0-1,1高0-2,1高0-3,1高0-4,1高0-5; 1中0-1,1中0-2,1中0-3,1中0-4,1中0-5; 1低0-1,1低0-2,1低0-3,1低0-4,1低0-5; LL-1,LL-2,LL-3,LL-4,LL-5(最低定量限. 2高0-1,2高0-2,2高0-3,2高0-4,2高0-5; 2中0-1,2中0-2,2中0-3,2中0-4,2中0-5; 2低0-1,2低0-2,2低0-3;2低0-4,2低0-5. 3高0-1,3高0-2,3高0-3,3高0-4,3高0-5; 3中0-1,3中0-2,3中0-3,3中0-4,3中0-5; 3低0-1,3低0-2,3低0-3,3低0-4,3低0-5. 操作:EP管加20ul药液(内标+药物,再加入空白血浆,沉淀蛋白,取上清液 氮气吹干,复溶,进样(每天进一批QC样品连续进三天。 (3QC样品(高、中、低,每个浓度3份,室温放置X h(实际操作过程中血浆放置 时间,再处理 编号:高X-1,高X-2,高X-3; 中X-1,中X-2,中X-3; 低X-1,低X-2,低X-3. 操作:EP管加20ul药液(内标+药物,再加入空白血浆,室温放置X h后,沉 淀蛋白,取上清液氮气吹干,复溶,进样。 (4QC样品(高、中、低,每个浓度3份,冻融24/48/72h,再处理 编号:高D-1,高D-2,高D-3; 中D-1,中D-2,中D-3; 低D-1,低D-2,低D-3. 操作:以高浓度为例:EP管加20ul药液(内标+药物,再加入空白血浆,将3份样品同时放入-20℃冻存,24h后取出融化后将高D-1按照大鼠血浆处理方法处理,另外两个再放入-20℃冻存,24h后取出融化后将高D-2处理,D-3再放入-20℃冻存,24h后取出融化后处理。 (5QC样品(高、中、低,每个浓度3份,处理后放置在自动进样器中Y h(实际进 样放置时间。 编号:高处-1,高处-2,高处-3; 中处-1,中处-2,中处-3; 低处-1,低处-2,低处-3. 操作:EP管加20ul药液(内标+药物,再加入空白血浆,沉淀蛋白,取上清液氮气吹干,复溶,在自动进样器中放置Y h再进样。 (6甲醇QC样品(高、中、低,每个浓度3份 编号:高醇-1,高醇-2,高醇-3; 中醇-1,中醇-2,中醇-3; 低醇-1,低醇-2,低醇-3. 操作:EP管加入20ul药液,再加入80ul甲醇,混匀即得。 (7取空白生物样品12份处理后取上清液,吹干,用甲醇QC样品复溶,测定 编号:高基-1,高基-2,高基-3; 中基-1,中基-2,中基-3; 低基-1,低基-2,低基-3. 操作:EP管加入20ul甲醇,再加入空白血浆,沉淀蛋白,取上清液,氮气吹干,加入100ul(6中甲醇QC样品复溶,进样。 2.2.2在操作时为了提