猪粪和土壤样品中微生物DNA提取方法的比较.docVIP

塑畜塑兽医学会家畜生态学分会２００６年学术会议论文集————三堕猪粪和土壤样品中微生物ＤＮＡ提取方法的比较 吴银宝史金才蓝小花陈文燕 （华南农业大学动物科学学院，广州５１０６４２） ［摘要］随着规模化养猪业的迅猛发展，猪场的粪污排放量急剧增加，在一定程度上对土壤微生物多样性造成影响．为了可以选用同一种ＤＮＡ提取方法研究猪粪对土壤微生物的影响，本文选用了化学裂解法和试剂盒法从土壤样品和猪粪样品中提取微生物的总ＤＮＡ，并对这两种方法提取ＤＮＡ的效果进行比较，以评价这两种方法的有效性．结果表明，试剂盒法无法用于提取土壤中的微生物ＤＮＡ；可以从猪粪中提取到ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增能得到目的产物，但重复性不高．化学裂解法处理土壤样品，提取的ＤＮＡ浓度高但纯度低，纯化后土壤样品的ＤＮＡ损失程度不同，但纯度有所增加，为后续的ＰＣＲ反应提供了浓度较高的微生物ＤＮＡ样品模板，ＰＣＲ扩增结果重复性不高；处理猪粪样品，提取的ＤＮＡ浓度较低但纯度比较高，ＰＣＲ扩增结果比较理想．由此可见，化学裂解法用来提取猪粪样品中的微生物ＤＮＡ是可行的，但需寻求更好的土壤样品微生物ＤＮＡ提取办法． ［关键词］猪粪；土壤；ＤＮＡ提取；微生物多样性 自上世纪八十年代以来，我国畜牧业特别是养猪业迅猛发展，规模化养猪业在提高生产效率的同时，猪粪、污水排放量急剧增加，给畜牧场环境卫生带来极大的困难，成为环境中重要的污染源之一。另外，在猪日粮中添加的抗生素、重金属、微量元素、激素、镇静剂或兴奋剂等，以及滥用违禁兽药和超量用药，都会增加猪粪尿等排泄物对环境生物的威胁程度。目前对猪粪的处理以利用为主，即与种植业相结合作为有机肥或将其作为鱼的饵料，这就可能导致土壤中微生物种类及数量发生变化。同时有研究表明，自然环境中微生物物种问经常发生基因及质粒等遗传因子的水平转移，转移的基因可与宿主基因重组形成具有特异功能的优势微生物类群，以适应改变了的环境【ｌ一，而且还可将这种优势的微生物类群从环境中分离、纯化，应用于污染环境的生物修复工程【列。因此在土壤中长期施用猪粪，会对土壤微生物多样性造成何种变化，这种变化会不会影响陆生生态系统的基本功能，都值得人们去研究和探讨。 目前常采用分子生物学技术进行微生物多样性的研究，这些技术的前提是要获得高浓度、大片断、多样性程度高、具有代表性的微生物ＤＮＡ，因此提取微生物ＤＮＡ在研究中就显的尤为重要Ｌ５刮。已报道的分别从土壤和猪粪样品中提取ＤＮＡ的方法有很多种，前者有张瑞福等【７】的ＳＤＳ高盐抽提法、陈敏［ｇｌ的冻融一溶菌酶－－ＳＤＳ结合法、黄婷婷等阴的间接法等；后者有黄俊文㈣的小珠撞击法和酶解法，刘健华【ｌｌ】等的珠磨法、冻融研磨法和酶法等，另外一些大型生物公司还分别研发出了土壤ＤＮＡ提取和猪粪ＤＮＡ提取的商业试剂盒。本文采用两种提取方法对土壤和猪粪的微生物总ＤＮＡ进行了提取，采用ＰＣＲ技术扩增提取ＤＮＡ中的细菌１６ＳｒＤＮＡ片断，以综合评价这两种方法对土壤和猪粪微生物ＤＮＡ的提取效果。 １材料与方法 １．１实验材料 本实验所用的实验样品采自东莞某猪场，具体情况如表ｌ所示。 【基金项目】华南农业大学校长基金资助项目． ［作者简介】吴银宝（１９７３。），男，博士，主要从事家畜生态学研究。Ｅ－ｍａｉｌ－蚴ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．。 中国畜牧兽医学会家畜生态学分会２００６年学术会议论文集 表１实验所用样品 样品代号 采集方法ｌ号样 ２号样 ３号样 ４号样 ５号样随机在猪舍周围空地采集表层土壤（０～１５ｃｍ）采集施用过猪粪的菜地表层土壤（０～１５ｃｍ）在猪场水塘周围每个水样采集点附近采集淤泥在粪污处理池周围采集固液分离后的粪渣在肉猪舍里面采集猪粪 １．２药品与试剂 磷酸盐、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、三（羟甲基）氨基甲烷（Ｔｒｉｓ，Ｂａｓｅ）（ｐＨ８．Ｏ）、十六烷基三乙基溴化铵（ＣＴＡＢ）、（氯化钠）ＮａＣＩ、蛋白酶Ｋ（１０ｍｇ／Ｌ）、氯仿、冰无水乙醇、双蒸水、ＴＥ缓冲液、超纯水等； ２０％的ＳＤＳ：先将２００９ＳＤＳ用９００ｍｌ水加热助溶，边加边搅拌，加几滴１Ｍ盐酸调ｐＨ值至７．２，定容至１升； 提取缓冲液：配比为０．１ｔｏｏｌ磷酸盐（ｐＨ８．Ｏ），０．Ｉｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｂａｓｅ（ｐＨ８．０），１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１．０％ＣＴＡＢ：玻璃珠ＤＮＡ胶回收试剂盒（产品号：ＳＫｌｌｌ）：上海生工生物工程技术服务有限公司； ３Ｓ柱离心式环境样品ＤＮＡ抽提试剂盒（Ｋ７１７厂７１８）：上海申能生物工程技术服务有限公司；ｄＮＴＰ、引物Ｐ３－ＧＣ和Ｐ２（见表２）、ＥｘＴａｇＤＮＡ聚合酶、１０ｘ缓冲液（ＭｇＣｌ２为２５ｍＭ）。 表２用于ＰＣ＿，Ｒ－－ＤＧＧＦ的引物 注：引物由上海基康生物工程公司合成 １．３试验方法与步骤 １．３．１猪粪和土壤微生物ＤＮ