生殖支原体粘附素蛋白MgPa的表达及其多克隆抗体的制备与纯化.docVIP

曾壅堡笠生蕉塞厦签整瞪苤堡自丛出笪壹姿盈基垒壹隆埴签数趔鱼皇丝丝筮！！塑 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｍ．１０００－４８４Ｘ．２０１０．１１．０１１ ?１０１ｌ? 生殖支原体粘附素蛋白ＭｇＰａ的表达及其多克隆抗体的制备与纯化① 曾焱华吴移谋游晓星詹利生粟盛梅邓红玉（南华大学病原生物学研究所，衡阳４２１００１） 中国图书分类号Ｒ３９２－３３［摘要】 文献标识码Ａ 文章编号１０００－４８４Ｘ（２０１０）１１．１０１１．０５ 目的：制备并纯化生殖支原体（№）粘附素蛋白（ＭｇＰａ）的多克隆抗体，为进一步探讨ＭｓＰａ的生物学功能及其 在Ｍｇ的临床诊断与预防方面的应用提供实验基础。方法：构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达生殖支原体粘附素蛋白（ｒＭｓＰａ’），重组蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定后用Ｎｉ．ＮＡＴ亲和层析柱纯化，然后免疫新西兰兔以制备兔抗ｒＭｇＰａ’血清。用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖４Ｂ亲和层析柱纯化多克隆抗体，并经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定免疫血清的特异性，用间接ＥＬＩＳＡ法检测免疫血清的效价。结果：在大肠杆菌中成功表达一分子量约为３７ｋＤ的６×Ｈｉｓ－ｒＭｇＰａ’融合蛋白，免疫新西兰兔后获得了相应的多克隆抗体，利用饱和硫酸铵法和亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的多克隆抗体，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析的结果表明所制备的多克隆抗体分子量约为１５０ｋＤ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明制备的抗体具有较高的特异性，ＥＬＩＳＡ结果显示抗体的效价为ｌ：２５ ６００。 结论：成功制备了高效价、高特异性的兔抗ｒＭｓＰａ’的多克隆抗体，为进一步研究ｌＶｌｇＰａ的生物学功能、Ｍｇ的临床诊断与预防提供了重要的实验基础。 ［关键词］生殖支原体；粘附蛋白；多克隆抗体；亲和层析 ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｔ７ｓｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｚＥＮＧＹａｎ－Ｈｕａ，ＷＵＹｉ－Ｍｏｕ，ＹＯＵＸｉａｏ－Ｘ０ｎｇ，ＺＨＡＮＬｉ－Ｓｈｅｎｇ，ｓＵＳｈｅｎｇ－Ｍｅｉ，ＤＥＮＧＨｏｎｇ－Ｙｕ．１ｎｓｔｈｕｔｅＢｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｏｆＳｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ４２１００１，Ｃｈｉｎａ ｐｒｅｐａｒｅａｎｄ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｒｉｄｉｎｇ ｎａｎｔ ａ ｆＨｌ曲ｒａｂｂｉｔａｎｔｉ—Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ａｃｈｍｉｏｎ砌（ＭｇＰａ）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ咖【ｉｂｏｄｙ Ｍ．膨毗以姗．Ｍ岫：１ｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｏｒｐｒｏ－ ｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｓｔｒａｙｏｆｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＭｇＰａａｎｄｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆ ｒｅｅｏｍｂｉ－ ｒｅ－ ｐｍｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｗａ￥ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏ／／ＲｏｓｅｔｔａＴＭ２（ＤＥ３）ｔｏｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭ．ｇ喊ｔａ／／ｕｍ．Ｔｈｅ ｅｏｍｂｉｎａｎｔｒａｂｂｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｒＭｇＰａ７）ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ａｎｄｔｈｅｎｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉ—ＮＡＴｉｍｎｍｎｏａｆｌｉｎｉｔｙｃＩｌＩＤｌ瑾Ｉｔｃ冒ｑ）ｌｌｙ．ＮｅｗＺｅａｌａｎｄｗｈｉｔｅｓｉｒｒ衄ｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｗｅｒｅ ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄｔｈｅｎｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｉｚｅｄｂｙＥＬＬＳＡａｎｄ ＣＮＢｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ＆叫｝黼４Ｂ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｍａ，ｏｄｙ．ｒＩｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓ啪ｗｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｌｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｓａｔｕｒａｔｅｄｍｌｌｌｎｏｎｉｕ／Ｉｉ ｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｒＭｇＰａ’．Ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭ．ｇｅｎ／ｔａ／／ｕｍ （ＤＥ３）．ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｈａｄｈｉｇｈ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏａｙｈａｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｉｔ’ｓｔｉｔｅｒａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｒｅｆｏｒｅｔｈｉｓｓｔｕｄｙｇｅｎ／ｔａ／／ｕｍ． ｃａｎ １：２５ ６００．蛐：Ｔｈｅ ｗ私ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ扔【ｐ蒯ｉｎ ｗａｓ ｍｍｂｏｄｙ惴ｃｈａｒａｃｔｅｒ－ Ｅ．ｃｏ／／Ｒｏｓｅ