超薄切片技术应用.pptVIP

切片的收集（捞片） 切片厚度的判断： 暗灰色 400 ? 灰色 〈 600 ? 银灰色 600-900 ? 金黄色 900-1500 ? 紫色 1500-1800 ? 蓝色 1900-2400 ?  样品的定位 取材时的定位 包埋时的定位 修块时的定位 海马 100倍.JPG CA3 400倍.jpg CA2 400倍.jpg CA1 400倍.jpg CA4 400倍.jpg DG 颗粒层 400倍.jpg 超薄切片的注意事项： （1）对刀是关键，对刀时要耐心、仔细 （2）水槽的污染问题 （3）环境的影响问题 超薄切片常见的缺陷及其消除方法： 破碎——脱水不彻底，有气泡，刀痕，颤痕，厚度不一， 带水 切片不成带，皱缩 切片染色 目的：提供样品本身的反差 常用染色剂：醋酸铀染色液 柠檬酸铅染色液 染色方式： 包埋前染色（块染） 包埋后染色（片染） 染色引起的人为缺陷 取 材 END 小鼠肝细胞电镜图片 以下图片由Dr.Liang提供 脱 水 脱水的目的及其影响脱水过程对样品影响在于对脂类的抽提并引起组织细胞的收缩。 脱水剂：乙醇 丙酮。丙酮比乙醇挥发性更强，脱水速度更快但更容易吸水而导致脱水不完全，且腐蚀性强。乙醇，因为它挥发性不强，毒性弱，与水的互溶性好。 脱水注意事项：脱水要彻底；脱水时间不宜太长；换液体要快；幼嫩及其含水多的样品从低浓度开始；固定剂易跟脱水剂反应生成沉淀 脱水过程：程序如下： 30% 乙醇或丙酮 5-10min 50% 乙醇或丙酮 5-10min 70% 乙醇或丙酮 5-10min 90% 乙醇或丙酮 10-15min 100% 乙醇或丙酮 三次，每次10-15min 脱水不足——组织块不硬化或硬度不够，切片厚度不均匀，树脂渗透不完全，从而引起样品块上产生空洞，造成切片到处有小洞，甚至使切片破碎。在市售的无水乙醇或丙酮中加些吸水剂，如无水硫酸铜或无水硫酸钠或加入分子筛等，以便吸去残余的水分。 脱水时间过长——某些细胞成分如脂类等物质易被乙醇或丙酮溶解。脱水时间可根据组织的性质和组织块的大小而定。结缔组织比一般较疏松的组织脱水时间略长些。若脱水当天无法完成时，样品可在70%乙醇中过夜。  更换液体时动作要迅速。特别是置换无水乙醇（或丙酮）时，注意不要让样品干燥，否则，样品内易产生小气泡，使包埋剂难以渗入，造成将来切片困难。固定后的样品必须用缓冲液充分冲洗后，才能进行脱水，否则四氧化锇与乙醇作用生成沉淀。每次加入的脱水剂体积至少要为样品的20倍体积。更换液体后容器的盖子必须盖紧，防止脱水剂从空气中吸水。  渗透、包埋 目的是使样品内部充满能耐受电子束照射的介质。这种介质就是包埋剂。良好的包埋剂应具备的特点：（1）有良好的硬度和切割性能；（2）有足够的低粘度，以保证能自由地渗入样品；（3）能溶于脱水剂；（4）透明度好；（5）聚合前后体积不变；（6）能经受电子束的轰击；（7）在高倍电镜下不显示本身任何微细结构等。 常用包埋剂: 脂溶性包埋剂－环氧树脂（Epon812、Spurr，618树脂） 环氧树脂(epoxy ?resin)是一类高分子聚 合物，分子中含有两种反应基团，即羟基和 环氧基。当加入酸酐类时，树脂分子中的羟 基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接， 这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂。 常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或十二碳烯基丁二酸酐，简称DDSA)、甲基 内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。当加入 胺类时，引起末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端 相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有2,4,6－三(二甲氨基甲基苯 酚) 简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性能，某些 环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂，使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑 剂为邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP) 水溶性包埋剂 Lowicryl系列包埋剂是专为低温包埋设计的包埋剂。它有两种类型：一种是极性树脂，K4M和K11M；另一种是非极性树脂，HM20和HM23。极性树脂亲水，使样品保存在