蛋白 A 亲和层析法纯化单克隆抗体工艺的优化.docVIP

Keywords: protein A, monoclonal antibody, purification, cell culture supernatant, acidic precipitation, host cell protein, histone, DNA 1986年，世界首个单克隆抗体 (Monoclonal antibody，简称单抗) 获得美国食品与药品监督管理局的上市批准，拉开了单抗药物发展的序幕，成为生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域最新发展方向[1-4]。目前全球医药产业正快速走向精准医疗时代，靶向药物单抗正是其中最为成熟的领域，仍将是继续引领生物制药发展最为重要的驱动力。 单抗药物通常是由中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese hamster ovary cell，简称CHO细胞) 表达产生。由CHO细胞分泌的这些高价值蛋白分 子，通过一系列纯化过程实现由细胞培养液中回收[5]。随着单抗生产上游基因改造、发酵条件的不断优化，其产量已达5?10 g/L；但这同时也大大增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。此外，宿主杂质的组成随着培养条件的改变呈现出显著的变化。单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。与产品相关污染物包括目标分子变异体、聚集体、以及由于不同翻译后修饰产生的产品变异体或降解产物。与工艺过程相关的污染物包括宿主细胞蛋白 (host cell protein，简称HCP)、宿主DNA、化学添加剂和残留培养基成 /cjbcn 分。在所有影响产品质量的污染物中，HCP和DNA占绝大多数。由于在理化性质上的差异 (分子量、等电点、疏水性以及表面电荷分布等) 使得HCP尤其难以有效完全去除，通常需要多个不同分离机制的单元处理进行分离去除，进而消除由任何微量存在的HCP所引起的严重的免疫反应[6-8]。 由于对于最终产品纯度、杂质量的严格要求 (HCP100 ppm、DNA10 ppb等)，单抗目前广泛采用三步纯化策略：粗纯 (样品捕获)、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的50%?80%[5]。用蛋白A亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首先步骤，一步纯化可使蛋白纯度达95%以上。但蛋白A树脂价格昂贵 (超过2.2万美元/升，GE报价)，在大规模生产中，蛋白A纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的35%以上[9-10]。因此，蛋白A纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[11-12]。 本研究通过分析pH、盐浓度对细胞回收液中各种宿主杂质的影响机制，确立低pH处理抗体细胞回收液的新型细胞液回收技术，提高了后续蛋白A纯化效率，减轻了纯化压力，与Capto adhere色谱纯化联用，真正实现两步法抗体纯化平台的建立。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 实验常用试剂均购自于Sigma-Aldrich。蛋 白A树脂MabSelectTM Sure， 混合型疏水性阴离子交换树脂CaptoTM adhere购自于GE ?： 010陈泉 等/蛋白A亲和层析法纯化单克隆抗体工艺的优化 Healthcare。蛋白A树脂Eshmono? A购自于Merck Millipore，蛋白A树脂ToyopearlTM AF-rProtein A-650 F购自于日本Tosoh Bioscience。UNOsphereTM Q阴离子交换树脂购自于Bio-Rad。以上层析介质均填充于XK或TricornTM系列色谱柱。所有色谱实验均于?KTATM Explorer 100 或 Avant 25 室温进行。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 生物仿制单克隆抗体IgG1 (赫赛汀?或Herceptin?) 由CHO (DG44, Life Technologies) 表达产生，利用新加坡科技发展局生物处理科技研究院开发的三顺反子载体[13]。抗体由5 L BIOSTAT? B搅拌式玻璃生物反应器生产 (Sartorius Stedim Biotech)，采用补料分批培养方式，利用1∶1的无蛋白培养基CD CHO (Life Technologies)和HyQ PF (GE Healthcare)。30%?50%细胞活力下收集细胞液。在室温、 4 000×g条件下离心20 min，之后经由0.22 μm滤膜 (Nalgene? Rapid-Flow Filters, Thermo Scientific) 过滤。澄清后细胞回收液贮存在2?8 ℃以供短