基因工程的下游技术重组蛋白的表达纯化和分析.pptxVIP

基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析; 重组蛋白的表达 表达体系： 表达载体 原核 受体细胞 真核;;选择表达载体常用的关键元件： 启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。） 融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚His标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析） 分泌信号 筛选标记 其它; ; 重组蛋白的纯化 亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 …… ; 本单元实验流程： 细菌（pEF-GFPuv） ;实验十 重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达;实验目的 实验原理 材料与试剂 实验仪器 操作步骤 注意事项 实验安排 思考与讨论;实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。;实验原理 操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。 乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。; 乳糖操纵子的诱导表达 当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。; 乳糖操纵子的诱导表达（续） 当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导。 乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。; 乳糖操纵子的诱导表达（续） 本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。在IPTG的诱导下，目的基因表达可增强105倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物的影响。;乳糖???纵子的降解物阻遏 当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolic repression）。;乳糖操纵子的降解物阻遏（续） 降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。 CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。; 阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调 当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。 这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。;The structure of lac operon;Repressor and negative regulation;异乳糖;异丙基硫代半乳糖苷; ;; 低乳糖时;材料与试剂 材料 含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。 试剂 LB 液体培养基 ： 蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL双蒸水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分装，高压灭菌，4℃保存。;氨苄青霉素溶液： 无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃保存，使用终浓度为50μg/mL或100μg/mL。 IPTG溶液： 将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用，贮存浓度为100 mM。 20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121℃，15min 灭菌，4℃保存。;实验仪器 超净工作台、 恒温摇床、离心机等。 ;操作步骤