第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法.pptVIP

4、毛细管电泳（CE） 5、电泳后的蛋白质检测 考马斯亮蓝染色：根据考马斯亮蓝可与蛋白质多肽链定量结合的原理建立。 活性染色：根据有活性的目标蛋白特有的生物化学反应产生的有色物质，或另外加入一种能与产物生成颜色的物质来进行检测。 免疫印迹：根据一种蛋白质（抗原）能与它产生的抗体专一地反应。 单克隆抗体（monoclonal antibody） 以待测抗原（或抗体）和酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，然后通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）的含量。 固定抗原 加入多种特定抗体 去除未能特异结合的抗体 加入酶标抗体 加入特异底物 底物溶液变色反应 免疫印迹测定（immunoblot assay） 蛋白质样品 凝胶电泳分离 转移至硝酸纤维膜 用同ELISA的方法处理 只有含待测蛋白质的条带显色 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 蛋白质的双向电泳 Western印迹 蛋白质一级结构的测定 直接测定法 化学测定法 质谱 间接测定法。 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。 蛋白质一级结构直接测定法的主要步骤 多肽序列分析实例 第四章 蛋白质的性质分类及研究方法 提纲 一、蛋白质的理化性质 二、蛋白质的研究方法 三、蛋白质的分类 蛋白质的理化性质 紫外吸收：最大吸收峰为280nm 两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定 胶体性质 沉淀反应：盐析、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀 变性、复性 水解 颜色反应 改变氨基酸残基侧链的离子化状态，从而影响蛋白质的电荷外布和氢键的稳定性。 （十二烷基硫酸钠） 能与蛋白质非极性侧链相互作用而破坏天然蛋白质的疏水相互作用。 尿素和胍离子 能与蛋白质内氢键基团形成更强的氢键 高度水溶性，增大了非极性侧链在水中的溶解度 破坏蛋白质分子内原有的疏水相互作用。 变性因素 变性原因 pH的变化 去垢剂 离液试剂 增大非极性物质在水中的溶解度，破坏蛋白质分子内部的疏水相互作用的能力 蛋白质变性 蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。 导致蛋白质变性的物理因素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。 蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包括：（1）溶解度降低。（2）黏度增加。（3）生物活性丧失。（4）更容易被水解。（5）结晶行为发生变化。 蛋白质的水解 蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是，酸水解会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp；碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，但不会破坏Trp；酶水解效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但不同的蛋白酶对肽键特异性不一样。 四种羧肽酶来源和特异性 几种蛋白酶特异性的比较 蛋白质的各种颜色反应 蛋白质研究方法 假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质? 蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小？ （SDS） 3.它的pI是多少？ （等电聚焦） 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？ （Western印迹） 5. 其一级结构如何？ （序列分析） 6.其三维结构又如何？ X-射线衍射和核磁共振 蛋白质纯化 准备工作 要解决三个问题： （1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。 纯化步骤： （1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定 ? 蛋白质的分离与鉴定 纯 度 蛋白质分离纯化步骤 提取 分离纯化 鉴定 组织匀浆、细胞破碎、盐析、离心、超滤 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析 高效液相色谱－质谱 双向电泳－质谱 注意：保持生物活性 分子大小 溶解度 电荷 特异生物学亲和力 高效液相层析 ——透析、超过滤、凝胶过滤 ——盐溶、盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀 ——离子交换层析、凝胶电泳 ——亲和层析 常用蛋白质的分离纯化方法 一、蛋白质的溶解性质与盐析分离 1、胶体性质 双电层 水化层和双电层是蛋白溶液稳定的两个因素 水化层 水化层 等电点条件时蛋白质净电荷接近零，溶解度最小！ 2、盐溶现象与盐析现象 很低盐浓度 —— —— —— ——盐浓度升高 盐溶：在盐浓度很稀低范围内，随着盐浓度的增加，球