分子生物学方式在微生物多样性.pptVIP

该方法主要缺点有二点: 一是需要与DGGE 相配套的电泳设备(电泳温度维持在60 ℃) 、价格昂贵; 二是当需要检测长于500 bp 的基因组DNA 片段单碱基变化时,需结合其它方法,如限制性内切酶法和RNA 探针法,付出更大努力方能达到这一目的. DNA 自动测序法 (3) DNA 自动测序法: 在4 个反应管中,具有不同的荧光特点的标记引物使每种碱基带有特异性. 在反应分别完成后,4种系列产物在一条泳道中电泳而被分离. 荧光标记的片段通过检测器时被监测,利用片段发射的特异波长和电泳迁移时间(指示片段大小、片段大小对应对于碱基在DNA 序列上的位置) 的不同而确定DNA 序列. DNA 序列数据分析 (4) DNA 序列数据分析: 通过PCR 得到特异性DNA 片段的碱基序列只是进化研究工作中的一个中间环节,最终还必须对这些数据进行分析推断. 目前分析序列数据的方法大量出现,如: GENEPOP 软件进行微生物遗传学数据分析、SPSS 和FSTAT 软件进行数据统计分析、TreeView 软件构建系统发生树. 我们可以从这些繁杂的序列数据中找出度量微生物遗传多样性的线索. 分子生物学技术在微生物生态研究中的应用前景 微生物具有变异快的特点,微生物的变异除了受到微生物本身的生理特性影响外,外界的环境因子对其变异的影响也是不容忽视的。 传统的微生物研究方法只能从微生物的形态学角度加以研究,而对于微生物受环境因子影响所造成的在分子水平上变异信息的捕捉能力是十分有限的。这就制约了微生物生态学研究的发展。 分子生物学技术的发展,就能将微生物在基因层面上所发生的变异与环境因子相结合,对维持微生物生态系统平衡的动力学参数进行深入研究。 第三节 基因重组和杂交育种 分子生物学方法在微生物多样性及微生物生态研究中的应用 微生物在生物圈的化学平衡中起着十分重要的作用,但我们对于维持这种平衡的微生物生态系统的构造和动力学参数知之甚少. 其中最大的原因就是：研究方法的局限性。 传统研究方法的局限性 传统的研究方法：通过纯培养获得菌株后，对其特性进行描述，即通过其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察) 的观察得到其特性。 在自然环境中能够纯培养的微生物菌株的数量还不到自然界微生物总数的1 %。由于纯培养是检测这些微生物性质的前提,因此这一限制使得自然界的大多数微生物特征很难被具体描述。 传统方法得到的性状为微生物进化关系的研究提供的信息很有限, 很难对微生物进行精确分类并构造系统发生树。 DNA 杂交技术 DNA 杂交技术和微生物分子系统学的发展使得我们可以摆脱纯培养条件的束缚,开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路。 理论上讲,微生物间的进化相关性是通过它们各自基因组的核苷酸序列(一级结构) 来决定的,对于单个基因的序列比较可以用于比较微生物相对进化关系。 典型的方法是比较不同微生物的类似基因并计算它们碱基序列的不同：微生物间的碱基数相差越多,所比较的微生物的进化关系越远。 数据用于计算所比较微生物的的进化距离，由此可以建立系统发生树或进化多样性图谱。 由于16S rRNA 或18S rRNA 的基因序列进化变化速率缓慢，所以它们常常被用于以分子生物学技术为基础的系统发生关系的研究. 近年来,随着从环境中提取微生物DNA 方法的不断改进 ,以核酸一级结构为依据对微生物进行分类方面的研究获得了长足的发展。 现代分子生物学技术用以研究微生物多样性克服了微生物培养技术的限制,能在遗传本质的层面上对微生物群落进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传多样性。 两界系统理论的建立 根据古微生物的化石标本分析,30 亿年前出现了自养细菌,20 多亿年前出现了蓝细菌,15 亿年前首次出现真核生物,即原核生物出现在先,真核生物出现在后。 基于以上分析,细胞进化上真核细胞起源于原核细胞。这就是早期生命进化的两界系统理论。 此学说认为所有的生命都可以划归这两界之一,而且认为原核生物类似于真核生物的祖先,因而真核生物就是从古代的原核生物进化而来的。 “三界”理论的建立 近20年来,细胞生物学与分子生物学的大量研究工作表明, 原核生物并不是统一的一大类,在极早的时候就已经分化为两大类:真细菌与古细菌。 “三界”理论的建立 建立在rRNA 一级结构信息基础上的系统发生关系的研究表明，原核生物应分为两界：古细菌和真细菌，这两界彼此不同。 古细菌、真细菌和真核生物三者之间不存在谁起源于谁的问题,而是相互平行的，三者都起源于共同的祖先,这一祖先称为原始细胞。 “三界学说”由此诞生,目前已利用rRNA 信息作为标尺建立了系统发生树。