2、蛋白质的显色反应.pdfVIP

实验二蛋白质的显色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。 2 、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3 、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应 1、双缩脲反应 （1）原理： o 尿素加热至 180 C 左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱 2+ 性条件下能与 Cu 结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（ 二肽 和氨基酸都不能发生双缩脲反应 ）。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应式如下： 双缩脲反应不仅为含有 两个以上肽键 的物质所有，含有一个肽键和一 个 -CS-NH2,-CH 2-NH2,-CHR-NH2 ,-CH2 -NH2-CH-NH2-CH2 -OH 或 -CHOHCH2NH2 等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。 NH3 也干扰此反应 ， 2+ 2+ 因为 NH3 与 Cu 可生成 暗蓝色的络离子 Cu （NH3 ）4 。因此， 一切蛋白 质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应 ，但有双缩脲反应的物质不一定 都是蛋白质或多肽。 （2 ）试剂 ①尿素，② 10%氢氧化钠溶液，③ 1%硫酸铜溶液，④ 2%卵清蛋白溶 液（改为蛋清溶液：水 =1：9） （3）操作 取少量尿素结晶， 放在干燥试管中。 用微火加热使尿素熔化。 熔化 的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10%氢氧化钠溶液约 1mL，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴 ，再振 荡。观察出现的 粉红颜色 。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝 色氢氧化铜能掩盖粉红色。 （由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不 都是紫红色 ） 向另一试管加 2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水 =1：9 ）约 1mL 和 10%氢氧化钠溶液约 2mL，摇匀，再加 1%硫酸铜溶液 2 滴，随加随 摇。观察 紫玫瑰色 的出现。 2 、茚三酮反应 (1) 原理 蛋白质、 多肽和各种氨基酸以及所有 - 氨基酸 均能发生该反应， 除 无 α- 氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应 外，其它均生成 蓝紫色化 合物 ，最终生成蓝色化合物。氨、 β- 丙氨酸和许多一级氨化合物都 有此反应。 尿素、 马尿酸、 二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。 因此，虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳 性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，第一步是 氨 基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱羧成醛，放出 CO2 、NH3 ，水合茚三 酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的 还原型茚三酮同另一个 水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色 物质。 反应机理如下： 蓝紫色 该反应非常灵敏， 1：150 万浓度的氨