水稻成熟胚组织培养体系初探.docxVIP

细胞学实验报告 细胞学实验报告 刘翰璋 刘翰璋 刘承宇 张胜文 熊兆钦课程名称 实验人员 水稻成熟胚组织培养体系初探 摘要：通过对成熟水稻种子进行表面消毒、愈伤组织诱导分化处理，对水稻胚组织培养体系进行初步探究，熟悉并学习植物组织培养技术。在诱导愈伤组织的过程中，诱导率在90%以上，诱导培养基配方为：MS+3ml 2,4-D+2ml 6-BA+2ml NAA，其中激素浓度均为0.5mg/ml。PH为6.5，黑暗中培养。 实验目的 本学期学习并掌握了动物细胞培养的基础技术（Hela细胞的传代培养），未曾学习植物细胞组织培养技术，故提出以水稻成熟胚进行组织培养体系的探究来学习掌握植物细胞组织培养的技术。 实验原理 背景：19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特 细胞全能性的理论是 植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯 蒂瓦特等人，用胡萝卜 韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过 脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过 再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、 茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用 纤维素酶与 果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工 培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行 细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做 愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 原理：植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。 MS 培养基是目前使用最普遍的 培养基。其具有较高的 无机盐浓度，能够保证组织生长所需的 矿质营养还能加速 愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS 固体培养基可用于诱导 愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其 液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS 培养基的无机 养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、 酪蛋白 水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它 培养基的基本成分相比，MS培养基中的 硝酸盐、钾和 铵的含量高，这是它的显著特点。 实验用品 材料：水稻成熟胚 试剂：蔗糖，琼脂，MS培养基，0.5mg/L 6-BA，0.5mg/L 2,4-D,0.5mg/L NAA, NaOH溶液，蒸馏水，70%与75%的酒精溶液，0.1%升汞溶液，过滤水 仪器：三角烧瓶，烧杯，玻璃棒，量筒，培养皿，微量移液器，枪头，电热炉，高压蒸汽灭菌锅，PH试纸，封口膜，皮筋或棉线，长镊子，解剖刀，超净工作台，定性滤纸，恒温培养箱 实验步骤及方法 MS培养基的准备 成分表 大量元素 成分 分子量 使用浓度 (mg/L) 硝酸钾?KNO3 101.21 1900 硝酸铵?NH4NO3 80.04 1650 磷酸二氢钾?KH2PO4 136.09 170 硫酸镁 MgSO4·7H2O 246.47 370 氯化钙?CaCl2·2H2O 147.02 440 微量元素 碘化钾?KI 166.01 0.83 硼酸?H3BO3 61.83 6.2 硫酸锰?MnSO4·4H2O 223.01 22.3 硫酸锌?ZnSO4·7 H2O 287.54 8.6 钼酸钠?Na2MoO4·2H2O 241.95 0.25 硫酸铜 CuSO4·5 H2O 249.68 0.025 氯化钴?CoCl2·6H2O 237.93 0.025 铁盐 乙二胺四乙酸二钠?Na2.EDTA 372.25 37.25 硫酸亚铁?FeSO4·7H2O 278.03 27.85 有机成分 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫