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实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司 1Real Time PCR基础知识2Real Time PCR实验方法3Real Time PCR解析方法4Real Time PCR应用实例主 要 内 容1Real Time PCR基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCR基础知识Real Time PCR用途定性分析定量分析绝对定量相对定量病毒及病原菌检测病毒及病原菌定量分析差异显示结果验证物种鉴定导入基因拷贝数解析基因芯片结果验证基因分型GMO定量检测siRNA效果确认mRNA表达量分析Real Time PCR的用途激发光发射光Ct值 Real Time PCR的原理Real Time PCR使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。1Real Time PCR基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCR基础知识Real Time PCR的检测方法SYBR Green I荧光染料嵌合法荧光探针法TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.荧光染料嵌合法（SYBR Green I）SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。SYBR Green IPrimer热变性 FFFFFFFFFFFFF退 火 PrimerPrimerPol.FPol.延 伸 SYBR Green I 法作用机理示意图FRTaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5’ 端标记一个报告基团（Reporter），3’ 端标记一个淬灭基团（Quencher）。 QPrimerQR热变性 PrimerPol.RQ退 火 PrimerRQPol.延 伸 TaqMan Probe法原理示意图 Probe法 One-Step RT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高 Probe合成费用高SYBR Green I 法与Probe法比较SYBR Green I 法 简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于mRNA表达量分析等常用于SNP解析，病毒、病源菌检测反转录反应2Real Time PCR实验方法Real Time PCR反应主 要 内 容RT Primer的选择 Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific PrimerOligo dT PrimerPCR F-PrimerPCR R-PrimerRandom目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。5’3’目的片段FR目的片段在距Poly(A) Tail 1.5 kbp 以内适用，RT效率较高。1,500 baseOligo dT Primer适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。5’3’AAA···目的片段FRRandom5’3’AAA···目的片段Gene Specific PrimerFOne Step RT-PCR 只能使用Gene Specific Primer，但不适用于复数基因的检出。ROligo dT Primer5’3’目的片段FRRT Primer的选择Real Time PCR引物设计Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同普通PCR引物目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。Real Time PCR引物目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。= 对引物设计要求严格扩增片段大小★80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)Primer长度★17-25 baseGC含量★40-60%(最好45-55%) Tm值★ ★ ★两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值序列★ △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端) △ 避免T/C连续，A/G连续3’ 末端序列★ △ 3’ 末端避免GC rich或AT rich △ 3’ 末端碱基最好为G 或C △ 3’ 末端碱基尽量避免为T互补性★ ★ ★ △ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列特异性★ ★ ★使用BLAST检索，确认引物特异性RT-PCR用引物★ ★ ★尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增Real Time PCR引物设计原则P