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分子生物学-第5章 构建打靶载体 同源重组 筛选中靶ES 显微注射 杂交删除neor基因 特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段 动物观察分析 Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序： 体外培养 需消除靶基因活性时： 通过与带有重组酶基因ES细胞杂交，可以把两个LoxP位点中间的DNA片段切除，使靶基因失活。 将标记基因的两侧也连入LoxP序列可在它影响靶基因转录时，将其删除。 从理论上说，可根据实验需要，设计在不同发育时期、不同空间任意敲除任何一个靶基因。 T-DNA：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。 Ti质粒：是根癌农杆菌染色体外的物质，为双股共价闭合的环状DNA分子。 报告基因：是一种编码可被检测的蛋白或酶的基因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。 （3）植物基因敲除技术 利用农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如插入目的基因内部或附近，就会影响基因的表达，从而使基因失活。 基因敲除的意义： ① 研究基因功能 ② 转基因动物的制备 ③ 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 1、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础. 酵母双杂交(yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 酵母双杂交由Fields在1989 年提出。其产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD)。 BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但 是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的 GAL4转录因子活性并可激活启动子,使启动子下 游基因得到转录. Fields 建立了一个双杂交系统，DB与X蛋白融 合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白- 蛋白复合物，使GAL4 两个结构域重新构成，启 动特异基因序列的转录。 一般地，将DB-X 的融合蛋白称作诱饵(bait),X 往往是已知蛋白，AD-Y 称作猎物(prey),能显示 诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对 报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间 是否存在相互作用。 酵母双杂交技术的基本原理 已知蛋白编码基因X 编码BD基因 cDNA不同片段Y 编码AD基因 诱饵基因 猎物基因 转化酵母细胞 报告基因 表达 不表达 X与Y编码蛋白有无相互作用 有 无 正向选择基因neo的作用机理？ 通常被插入到靶基因功能最关键的外显子中， 或通过同源重组置换靶基因最重要的功能域，以 使靶基因彻底失活。 利用筛选培养基检测是否存在选择标记基因， 可以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中。 Cre重组酶的作用？ 能介导两个34bp的LoxP位点之间的特异性 重组，使LoxP位点间序列或基因被删除。 LoxP位点？ 是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp 序列共同组成。 13bp反向重复序列是Cre酶的结 合域。 Ti质粒？ 是根癌农杆菌染色体外的物质，为双股共价 闭合的环状DNA分子。 报告基因？ 是一种编码可被检测的蛋白或酶的基因，是 一个表达产物非常容易被鉴定的基因。 酵母双杂交技术的意义？ 酵母双杂交是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 酵母转录因子GAL4的结构？ GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域。 位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD) 。 2、酵母单杂交法（yeast one-hybrid） 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析 DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法。 特点：通过该