第五章 DNA的损伤与修复.pptVIP

第五章 DNA双螺旋结构发生的任何改变。 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要； 碱基类似物 5-溴尿嘧啶（5-Bu） 突变的效应 错义突变（missense mutation）是指碱基替代后mRNA中编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。 单碱基对的置换后形成新的密码子，编码另一种氨基酸，最终产生另一种蛋白质，有可能影响、改变或丢失原有蛋白质产物的功能，或获得新的功能。 同义突变（samesense mutation）：碱基对发生替换后，mRNA中密码子发生改变，但编码蛋白质中相应位点的氨基酸不发生改变，也叫沉默突变。 无义突变（nonsense mutation）是由DNA的碱基突变使mRNA中编码氨基酸的密码变成终止密码UAA、UAG或UGA。 在相应位点会导致翻译提前终止，产生一条没有功能的缩短的多肽片段，通常对蛋白质的功能有严重的影响。 如GGA（甘氨酸 ） UGA（无义终止密） 移码突变（frameshift mutation） DNA分子中，编码区碱基缺失或增加非3的倍数，造成之后的一系列密码子发生移位的现象。 粘性末端的意义： （1）DNA连接便利 不同的DNA双链，只要粘性末端碱基互补就可以连接，且连接效率高于平末端 同一个DNA分子内连接，通过两个相同的粘性末端，可形成环形分子。 （2）5’末端标记 突出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶进行32p标记； 突出的3’末端可以用末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴 （3）补齐成平齐末端 根据需要，粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端 Ⅱ类限制性酶的酶活性： 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度和PH等条件下才表现最佳切割能力和位点专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液！ 如果改变酶的反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星星（＊）活性。 5.4 基因重组交换的分子机制 本章重点内容 DNA受损的原因 DNA突变的类型 突变修复的几种机制 Ⅱ类限制性内切酶的特点 SOS反应的起始： 诱导信号: 严重的DNA损伤产生大量单链缺口 起始因子: 重组蛋白RecA的水解酶活性被激活 RecA的激活导致阻遏蛋白LexA自我催化引起自身的裂解，同时使许多与修复相关的基因被激活 LexA是一种小分子蛋白，具有蛋白酶活性，是很多操纵子的阻遏物（调控基因的产物）。RecA的激活使LexA的阻遏功能失去活性，从而诱导了它所结合的操纵子结构基因的表达。  和SOS反应有关的基因，包括RecA，lexA, UvrA, UvrB, umuC 和 himA。RecA也触发细胞中其它靶物质的剪切，包括各种原噬菌体的阻遏蛋白。 SOS修复 5.3 限制与修饰 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰 （restriction and modification） 。 大肠杆菌C无限制系统 实验结果： 从3种不同菌株繁殖出来的噬菌体后代，接种到同样菌株，接种率达100％； 如接种到不同菌株上，情况便不同； λ(k)在B株上接种效率只有10-4，λ(B)在 k株上也只有10-4； 如将生存下来的噬菌体接种到第一轮同样的菌株中，如λ(k)→λ(B)→B, 则接种效率为100％。 推论： 大肠杆菌含有一种限制修复系统，限制酶能够将外来DNA切断；修饰酶（甲基化酶）通过将自身腺嘌呤（GATC）或胞嘧啶（CCA/TGG）甲基化对自身DNA进行修饰，因此不会将自身DNA降解掉； 当外来噬菌体进入大肠杆菌后，绝大部分被限制酶所降解，极少数被甲基化酶所修饰而幸存下来；修饰后的噬菌体再进入大肠杆菌，不会被降解。 细菌为对付外来DNA和保护自己DNA而演化来的。 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 I类限制性核酸内切酶 1）是异源多聚体，包含三个亚基R、M和S，其功能分别为限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异位点识别。 2）识别未甲基化的特异序列，切割位点与识别位点相隔1-5kb，切割位点无序列特异性，需ATP，Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸） 。 3）种类较少，最早从大肠杆菌的B菌株和K菌株分离得到。 限制性核酸内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素可划分为三类： III类限制性核酸内切酶 1） III类限制性核酸内切酶由R亚基和MS亚基组成，其中R亚基具有限制性内切酶