浙江大学刘振伟教授高级培训班膜片钳技术数据处理与分析.ppt

Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 单通道记录数据的分析 单通道开放概率分析实例 以机械敏感性MscL通道为例，单通道开放概率Po的计算过程如下： （1）打开单通道数据文件，进行数据处理 （2）进行事件检测 （3）计算Po （4）作压力-单通道开放概率关系曲线 （5）对压力-单通道开放概率关系曲线进行拟合 Pressure-Po关系曲线 Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 单通道记录数据的分析 Clampfit中的拟合方程：Boltzmann, charge-voltage 设： f(V)=Po，单通道开放概率 Vc=1/α，通道对负压的敏感度（mmHg），拟合获得的重要指标 V=P，施加的负压值 Vmid= P1/2，通道50%开放时的压力值，拟合获得的重要指标 Imax=1，以通道100%开放为1 C=0，Po的位移设为0 则上述方程可以写成右侧的Boltzmann方程： Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 单通道记录数据的分析 Clampfit演示单通道开放概率Po的计算 Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 单通道记录数据的分析 注意： 单通道概率分析的前提是：能观察到膜片上全部通道开放的情况，进而知道膜片上通道的最大数目。 Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 单通道记录数据的分析 三、多通道开放概率 NPo的概念 膜片上通道没有全部开放，通道总数N未知，Po无法计算，只能计算NPo——多通道开放概率。 单通道开放概率Po=NPo/N。 压力—Npo曲线用Boltzmann方程拟合。 Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给予电压刺激时，失活的通道将不再开放——稳态失活（Steady-state inactivation）。用失活曲线反映。 全细胞记录数据的分析 四、离子通道的失活曲线 2nA 10ms -50mV Conditioning pulses Testing pulses Vh= -90mV Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据 条件脉冲——将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态。 测试脉冲——检测未失活通道的电流大小。 X轴——条件脉冲的电压数值 Y轴——测试脉冲的电流大小 用Boltzmann方程拟合 全细胞记录数据的分析 2nA 10ms -50mV Conditioning pulses Testing pulses Vh= -90mV Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 I：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小 Imax：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流 Vm：不同条件脉冲电压 V1/2：通道失活50%时的条件脉冲电压 k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢） 全细胞记录数据的分析 Boltzmann方程 Vm Imax /2 V1/2 0 Imax Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 全细胞记录数据的分析 Clampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程 设： f(V) = I Imax=－1 Vmid=V1/2 V=Vm Vc=k C=1 则即为前述的失活曲线方程： Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 失活曲线制作步骤 （1）对数据进行分析前的处理：基线调零、滤波等。 （2）测量不同条件脉冲下的测试脉冲诱发的全细胞电流峰值（I）。以测试脉冲的全细胞最大电流峰值Imax为1，对其它电流标化，计算出I/Imax。 （3）以Vm为x轴，I/Imax为y轴，作点图。 （4）最后用失活曲线方程对散点图进行拟合。打开Clampfit中的Fit窗口，选择Boltzmann, charge-voltage方程。 全细胞记录数据的分析 Patch clamp training class Apr. 23-25, 2014 全细胞记录数据的分析 Clampfit演示失活曲线的制作 Patch clamp training class