DNA提取方法和试剂作用汇总.docxVIP

1 试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、 中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc，Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。 2 DNA 提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而 有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理 法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用 SDS 处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或 蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与 DNA 结合的组蛋白。 将 DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为 DNA 在醇中不可溶而 黏在一起，这一步也能除掉盐分。 另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取 DNA 的商业化试剂盒。 DNA 提取的几种方法 (1).浓盐法 利用 RNA 和 DNA 在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用 1M 氯纳抽提,得到的 DNA 粘液与含有少量蛋白质 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心 除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而 DNA 位于上层水相中,用 2 倍体积 95%乙醇可将 DNA 钠盐沉淀出来. 也可用 0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去 RNA,再以 1MNaCL 提取脱氧 核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. C.以稀盐酸溶液提取 DNA 时,加入适量去污剂,如 SDS 可有助于蛋白质与 DNA 的 分离。在提取过程中为抑制组织中的 DNase 对 DNA 的降解作用,在氯化钠溶液 中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M 柠檬钠,并称 SSC 溶液,提取 DNA. （2）.阴离子去污剂法; 用 SDS 或二甲苯酸钠等去污剂使蛋 白质变性,可以直接从生物材料中提取 DNA .由于细胞中 DNA 与蛋白质之间常借 静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去 污剂提取 DNA 苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚 处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团 与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。离心分层后取出水层， 多次重复操作，再合并含 DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀 DNA 。此时 DNA 是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的 特点是使提取的 DNA 保持天然状态 水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去 RNA，然后将沉淀溶于水中，使 DNA 充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清 中加入固体氯化钠调节至 2.6M.加入 2 倍体积 95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后 分别用 66% ，80%和 95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得 DNA 样品. 此法提取的 DNA 中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在 提取过程中加入 SDS. 1.动物来源的 DNA 的提取 1. 1 经典提取方法 酚抽提法 、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取 DNA 最为经典的方法，目前很多方法 的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶 K 和十二烷基硫酸钠 (SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异 丙醇沉淀 DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与 DNA 的结合，然后利用透 析来处理 DNA 样品。这些经典方法获得的 DNA 纯度很高，能够满足各种试验的要求，但 操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。 1.2 玻璃棒缠绕法 该 法 用 盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的 或前端为 U 形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状 DNA 缠绕在玻璃 棒上。玻璃棒上的 DNA 经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸 人 TE 中过夜，使