基因的表达、调节与产物纯化.pptVIP

(4) 产物分离 用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从 GST上切下来。 (5)其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6 个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA （或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。 六、影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 (1)一致顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 (3) -35区和-10区的碱基顺序 (2) -35区与-10区之间的距离 间隔为17bp时，启动子最强。 2. 转译起始序列对表达效率的影响 (1) S-D序列 5’-AGGAGGU-3’ S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。 (2) 起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响。 β-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 大肠杆菌乳糖操纵子控制区的结构 （3）色氨酸启动子trp 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。 （4）PL和PR启动子 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1.细胞质中表达 包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知。 ① 优点 ② 缺点 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 回收的蛋白生物活性差。 例： 在大肠杆菌细胞内表达人生长激素 （human growth hormone, hGH）。 2.周质中表达 （1）周质（periplasm） 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理 目前不完全清楚 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。 ①常用的原核信号肽 （2）信号肽（signal peptide） 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 一般位于N端。 ①大肠杆菌的信号肽： phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、 β-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 ②金黄色葡萄球菌的蛋白A。 ③枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。 ④胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。 ②真核信号肽 也能在细菌中起作用。 鼠源RNase、人生长激素信号肽。 3.胞外表达 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白； 或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。 五、几种类型的原核表达载体 1.非融合型表达载体 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点： 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。 pKK223-3 载体 哈佛大学Gilbert实验室建立的。表达能力强。 组成结构： ① 强启动子: tac（trp-lac）: trp的-35区 lacUV5的-10区 ②操纵基因： 乳糖操纵子系统。 lac操纵基因 举例 ③调节基因： 宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如 JM105菌。 Lac I ④终止子： rrnB的强终止子 rrnB强终止子 ⑤S-D序列和插入位点区： S-D 插入位点区 ⑥载体的其余部分： 来自pBR322质粒。 ⑦表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解） 宿主lac I tac P Lac O S-D 插入位点区 rrnB T 阻遏物 IPTG 2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽 连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 如：pIN III系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 组成结构 ① 强启动子： Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 ②调节基因：lac I ③S-D序列和起始密码ATG。 ④分泌信号肽： 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 ⑤插入位