- 1、本文档共33页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
;基因库(gene pool):特定生物体全基因组的集合(天然存在)
基因文库(gene library):从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同,基因文库分为:;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;;; 超声波处理后的DNA片段呈平头末端,需加装人工接头
部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶,如:Sau3AI或MboI等,这样DNA酶解片段的大小可控。;3、载体和受体的选择与制备
出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或柯斯质粒;对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。
由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb,因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或插入型l载体。;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;第二节 cDNA基因文库的构建;二、cDNA文库的构建:
1、RNA的分离
mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA,而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪,平均为2%,mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小,因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量,可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。
1)根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件,用于提取RNA。
2)保持mRNA的完整性,是构建全长cDNA文库的核心。
3)选取合适的提取方法,除完整性外,mRNA还要求纯度高、DNA污染少,最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。
4)RNA定量准确,保存合理。
5)根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。;2、第一链cDNA的合成
由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT),由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶,合成DNA是需要引物引导。常用的引物有:
oligo(dT)引物:在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物, oligo(dT)引物与mRNA 3’末端的poly(A)配对,引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA,反转录的是整个表达谱,可以产生全长cDNA,应用最广。
随机引物:与mRNA分子内的多处配对,从多个位置合成cDNA第一链,反转录的几乎是整个表达谱,最多只能产生近全长cDNA,适合于得到总cDNA的5’末端。
基因特异引物(gene-specific primer, GSP):仅反转录特定目标基因cDNA的5’末端。
有AMV和MMLV两种RTase,最适温度分别为42℃和37℃,需要敲除其RNase H活性,较高温度反转录有利于打开mRNA的二级结构,得到全长cDNA。
反转录过程中要防止mRNA降解,可以添加RNase抑制剂。;3、第二链cDNA的合成
cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。 4种cDNA第二链合成的方法:
自身引导合成法:解离的cDNA第一链的3’末端会产生一个发夹状结构,可以引导第二链的合成,然后用S1核酸酶处理去除发夹结构。得到的5’不完整,且S1核酸酶处理不好控制,易导致cDNA的丢失,所以该法现已少用。
置换合成法:RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶联合处理,得到近全长cDNA,5’缺失短序列。
引导合成法:利用末端转移酶在cDNA第一链的3’末端加上poly(dC)尾巴,利用poly(dG)为引物引导第二链合成,利用同源多聚尾与载体进行重组。
引物-衔接头合成法:引导合成法的改进型,在反转录引物和poly(dG)引物的5’引入优化设计的人工接头,可用PCR扩增广大总cDNA,也为总cDNA与载体的连接提供了酶切位点。;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术专业 基因工程;西南大学 生物技术
您可能关注的文档
- 产品经理培训2.pptx
- 健康心理和不健康心理的具体内涵.pptx
- 宾语从句口诀.pptx
- 分析问题和解决问题能力.pptx
- 平衡移动与平衡转化率之间的关系.pptx
- 83长方体中棱与棱位置关系的认识.pptx
- 危险货物的分类包装和标志标记标牌的要求.pptx
- 园艺植物遗传育种.pptx
- 八年级历史二次鸦片战争期间列强侵华罪行.pptx
- 中考数学复习概率人教版教学.pptx
- 原电池电动势的测定实验报告.pdf
- 与业主、设计、总包、监理和他承包人的配合措施.pdf
- 公司管理流程.pptx
- 2024_2025学年新教材高中地理第1章地球的运动素养综合训练新人教版选择性必修1.doc
- 2024_2025学年新教材高中地理第3章大气的运动第1节常见天气系统第1课时锋与天气分层作业新人教版选择性必修1.doc
- 2024_2025学年新教材高中地理第1章地球的运动第2节地球运动的地理意义第4课时正午太阳高度的变化四季更替和五带划分分层作业课件新人教版选择性必修1.pptx
- 2024_2025学年新教材高中地理第2章地表形态的塑造第2节构造地貌的形成第1课时地质构造与地貌课件新人教版选择性必修1.pptx
- 2024_2025学年新教材高中地理第1章地球的运动问题研究人类是否需要人造月亮课件新人教版选择性必修1.pptx
- 五片小雪花课件.pdf
- 2024_2025学年新教材高中地理第3章大气的运动第2节气压带和风带第1课时气压带和风带的形成分层作业课件新人教版选择性必修1.pptx
文档评论(0)