《生物制药》人源化单克隆抗体.ppt

2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody) 真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。 不足 有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。 改良方案 ——进行SDR移植改良 嵌合抗体 人源化抗体 3个CDR 3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody) 在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗体潜在的免疫原性降至最低。 4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody) 它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。 在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。??? 4.1.抗体库筛选技术 4.1.1.噬菌体表面展示技术 鼠源抗体 完全人源化抗体 基本原理和程序? 噬菌体抗体库 人免疫细胞基因组 PCR技术扩增 整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因 噬菌体DNA中有抗体基因 外壳表面有抗体分子的表达 克隆并以融合蛋白的形式表达 基因重组 噬菌体重组DNA 构建 利用抗原-抗体特异性 筛选所需抗体并进行克隆扩增 获得可溶性抗体片段 表达 局限性 1.在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。目前，常用的噬菌体展示文库容量在109。 2.不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需要外加选择压力。 3.噬菌体展示文库无法进行有效的体外突变和重组进而限制了文库中分子遗传的多样性。 4.因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很难得到有效表达和展示。 4.1.2.核糖体展示技术 基本原理和程序? 人免疫细胞基因组 EDTA 体外转录、翻译、偶联 mRNA-核糖体-蛋白质三聚体 核糖体展示的蛋白文库 构建 基因型和表型联系 利用抗原-抗体特异性 筛选所需抗体复合体 EDTA解离 获得特异mRNA RT- PCR RT- PCR 特异抗体DNA子文库 获得特异性的、高亲和力的抗体 表达 传统的筛选技术具有本身难以克服的缺陷，主要表现在构建文库和筛选时都涉及细胞转染、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白质降解等诸多方面的问题，文库容量及其分子多样性在某种程度上受到很大的限制，降低了文库筛选效率。 核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大的提高了文库容量和筛选通量（1012-1014）而且能够增加表达的蛋白质的溶解度。 优势 4.2.转基因小鼠 通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。 案例： 日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。 但迄今尚无该技术生产的制品问世。 4.3.微胞杂交干细胞技术 ——日本学者Ishida等首先提出 技术要点： 首先将抗G418的人成纤维细胞与小鼠的A9细胞融合，通过筛选，得到抗G418的小鼠A9细胞，再运用PCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋水仙素处理48h，然后用细胞松弛素B处理并高速离心，分离出含2号、14号、22号染色体的小鼠。 人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。 4.4.其他方法 XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗。 基因型和表型联系 人源化单克隆抗体的 研究进展和应用 09生物技术 单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，鼠源性单抗应用于人类的临床应用结果反映出了单克隆抗体药物存在的一些问题 : (1) 鼠源性单抗容易容易产生人抗鼠抗体(HAMA) ,在体内作为异源蛋白被清除掉，从而削弱其治疗的有效性 。 (2) 鼠源性单抗在人体内生物活性降低，不能有效地激活人体的生物效应。 研究背景 因