临床免疫学—肿瘤标志物的检测-实验.ppt

肿瘤标志物的检测 实验目的 掌握ELISA定量检测方法； 熟悉检测肿瘤标记物的常用方法； 实验原理 (甲胎蛋白定量检测) 双抗体夹心法： 抗-AFP单克隆抗体包被反应板，加入待测标本或标准品孵育后，洗涤后，再加入HRP标记的抗-AFP多克隆抗体。如果标本中含有AFP，就能在固相载体的表面形成(抗-AFP单克隆抗体)-AFP-(HRP-抗-AFP多克隆抗体)复合物，加入底物后产生显色反应； 在一定范围内，吸光度OD值与标本中的AFP含量的对数值成线性关系； 通过同步检测已知浓度的AFP标准品并计算标准曲线后，将待测标本OD值代入回归方程后即可求出待测标本中AFP含量。 主要试剂与器材 1、待测标本 2、微孔反应板 3、酶结合物 4、AFP标准品（20、50、100、200、400 ng/ml） 5、质控品（ 50、200 ng/ml ） 6、显色剂A/B 7、浓缩洗涤液（用前25倍稀释） 8、终止液 9、酶标仪（450/630nm） 实验步骤 1、准备反应孔：每组设2个质控品和5个标准品各2孔，阴性对照、样品1、样品2各1孔（17）； 2、加样：相应反应孔中加入标本或样品各50μl,振荡混匀，封板，置于37 ℃孵育20分钟； 3、洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置10秒，弃去孔内液体，重复5次，最后一次在吸水纸上拍干， 4、加酶结合物：每孔加酶结合物50μl，封板，置于37 ℃孵育20分钟； 5、洗板：重复步骤3； 6、显色：每孔加入显色剂A、B各50μl，振荡混匀，封板，置37 ℃孵育10分钟； 7、终止反应：每孔加终止液50μl，混匀； 8、读板：在450nm主波长，630nm副波长下，用酶标仪检测各孔吸光值（OD值）； 9、检测结果的计算： 以标准品AFP浓度的lg值为自变量（x），其对应的吸光值（OD值）为应变量（y），求出回归方程，将待测标本的OD值代入回归方程，求得其AFP含量。 标准品浓度ng/ml 20 50 100 200 400 lg值 1.301 1.699 2 2.301 2.602 实验结果的判断与解释 1、阴性对照标本OD值≤0.05, 20ng/ml标准品OD值≥0.15; 2、质控品50ng/ml测定值应在50ng/ml ±20％范围内； 质控品200ng/ml测定值应在200ng/ml ± 20％范围内； 1、正常参考值≤20ng/ml; 2、肝炎患者AFP含量一般在20－400 ng/ml; 3、妊娠期间，母体AFP会升高，异常妊娠会引起AFP含量较同期正常妊娠偏高或偏低； 4、原发性肝癌患者AFP含量一般大于400ng/ml。 方法学评价 1、仅适用于血清标本的检测，不适用于其它体液 标本； 2、AFP400ng/ml时，需用阴性或低浓度血清标本 稀释后重新测定再按稀释倍数，计算AFP含量； 注意事项 1、从冷藏环境中取出的试剂盒应在室温平衡30分钟后再打开使用； 2、使用前试剂应摇匀； 3、封板胶纸不能反复使用； 4、严格控制孵育时间、显色时间和读板时间； 5、标本的要求 思考题 1、什么是肿瘤标记物，常见的肿瘤标记物主要分为哪几类？