分子生物学综述论文(基因敲除技术).docxVIP

题 目  现 代 分 子 生 物 学 课 程 论 文 基因敲除技术 班 姓 成  别 名 绩  生物技术 10-2 学号 10114040220 陈嘉杰 [1 [1] [2] 基因敲除技术的研究进展 要摘 基因敲除是自 80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途 径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此后经历了近 20 年的推广和应用，直到 2007 年 10 月 8 日，美国科学家马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁?埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金 星定向修饰原理方面的系列发现分享了 2007 年诺贝尔生理学或医学奖。基因敲除技术从 此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。本文就基因敲除的研究进展作 一个简单的综述。 关键词 基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组 前言 基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组，进行精 确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体 DNA 可与目的片段共同稳定遗传等特 点。应用 DNA 同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该 细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲 除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学 研究领域取得了突破性进展。上述起源于 80 年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属 完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术 的研究始于 1993 年。Tsien 等 于 1996 年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基 因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以 Cre/LoxP 系统为基础，Cre 在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000 年 Shimizu 等 于 《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以 Cre/LoxP 系统为基础，利用四环素等诱导 Cre 的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上 可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 2004 年该实验室 Cui 等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的 模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基 因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成为目前功能基因组 和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除是自 80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使 机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原 理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的 发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和 iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是 80 年代后半期应用 DNA 同源重组原理发展起来的。80 年代初，胚胎干细胞 （ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺 [1][2][4][5,6] [1] [2] [4] [5,6] 乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987 年，Thompsson 首次 建立了完整的 ES 细胞基因敲除的小鼠模型 。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲 除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.2 条件性基因敲除法 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某 一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法 。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用 重组酶 Cre 介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控 的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态 2.1.2.1 条件性敲除的原理 利用 Cre／LoxP 和来自酵母的 FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因 灭活所导致的表型 。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的 1oxP， 并以此两侧装接上 loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将 “loxP f