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分子生物学实验报告 专业：****** 学生姓名：*** 目录：  班级：*** 指导老师：** 实验一 实验二 实验三 实验四  质粒 DNA 的小量制备 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定 感受态细胞的制备及转化 PCR 扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 2010.05.29 １ rr r r 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。 为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物 学实验技术。它的内容包括质粒 DNA 的制备；DNA 的重组；PCR 基因扩增等等。 实验一  质粒 DNA 的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带 外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是 DNA 体外重组的重要条 件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源 基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量 扩增；（3）载体 DNA 链上有 1 到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入； （4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc ），抗新霉素基因（Ne ）等，以此知道它 是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述 条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在 1～120kb 之间，具有双链闭合环状 结构的 DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代 细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细 菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型 （relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个 细胞内只含有 1 个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷 贝，一般在 20 个以上。通常大的质粒如 F 因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如 ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素 E1 基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成 抑制剂－氯霉素时，染色体 DNA 复制受阻，而松弛型 ColEⅠ质粒继续复制 12－16h，由原来 20 多 个拷贝可扩增至 1000－3000 个拷贝，此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量由原来的 2％增加到 40％－50％。本实验分离提纯化的质粒 pBR322、pUC19 就是由 ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒 DNA 的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和 纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和 阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来， ２ 6 76 6 7 6 6 而质粒 DNA 则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒 DNA。 质粒 DNA 的相对分子量一般在 10 －10 范围内，如质粒 pBR322 的相对分子质量为 2.8×10 ，质粒 pUC19 的相对分子质量为 1.7×10 。在细胞内，共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简称 cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处 断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环 DNA（open circular DNA，简称 ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和线状 DNA 的泳动速度快，因此 在本实验中，自制质粒 DNA 在电泳凝胶中呈现 3 条区带。 二、实验目的 ．掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法和检测方法。 ．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂 材料：大肠杆菌 E.coli，含 pBR322 质粒。 试剂： LB 培养基：10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L NaCl，用 NaOH 调 pH 至 7.3 左右。 如固体培养基则添加 15g/L 琼脂。 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T 缓冲液）：50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L