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分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008 年 8 月 实验一 分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛 选；PCR 技术等。 1 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的常用方法。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳 动时有电荷效应和分子筛效应，DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向 正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净 电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从 200bp 至 50 kb 的 DNA 片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在 紫外光下可以检出 10ng 的 DNA 条带，在电场中，pH8.0 条件下，凝胶中带负电荷的 DNA 向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： DNA 的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越 大迁移得越慢。 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各 不相同。DNA 电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压 低电压时，线状 DNA 片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增 加，不同分子量 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的 有效分离范围将缩小。要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过 5v/cm。 (4) 电泳温度 DNA 在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大 小的 DNA 片段其相对迁移速率在 4℃与 30℃之间不发生明显改变，但浓度低于 0.5%的凝胶 或低熔点凝胶较为脆弱，最好在 4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA，染料嵌入到堆积的碱基对 间并拉长线状和带缺口的环状 DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低 15%。 (6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 电泳迁移率。在没有离子存在时 （如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA 几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如 误加 10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。 对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有 TAE、TBE 等，一般配制成浓缩母液，室温 保存，用时稀释。 2 [实验仪器与设备] 1. 恒温培养箱 3. 高压灭菌锅 [实验材料]  2. 琼脂糖凝胶电泳系统 4. 紫外线透射仪 1.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝 5.蔗糖 7.溴化乙锭 9.DNA 样品 6.琼脂糖 8.DNA marker [实验步骤] 1.缓冲液的配制 ① 5×TBE(5 倍体积的 TBE 贮存液) 配 1000mL 5×TBE: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/l EDTA 20mL Ph8.0 ② 凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 蔗糖 0.25% 40% ③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/mL 2.制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度 线性 DNA 的有效分离范围 0.3% 5-60 kb 0.6% 1-20 kb 0.7% 0.8-10 kb 0.9% 0.5-7 kb 1.2% 0.4-6 kb 5% 0.2-4 kb 0% 0.1-3 kb 胶板的制备 3 (1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘的开 口）封住，形成一个胶膜（将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正）。 (2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（1×TBE）。准确称量的琼脂 糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的 50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的 电泳缓冲液，离子强度或 pH 值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响 DNA 片段 的迁移率 。 (3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉 中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并 暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。 (4) 使溶液冷却至